孫智媛，梅力文，黃興國(guó)，李穎慧

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南家禽安全生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙 410128）

近年來(lái)，隨著我國(guó)飼料中抗生素的使用被全面禁止，人們對(duì)優(yōu)質(zhì)肉蛋奶的需求日漸提升，如何保障畜禽健康成為我國(guó)畜牧業(yè)的一大挑戰(zhàn)，安全高效、環(huán)境友好的抗生素替代品成為研究焦點(diǎn)。以發(fā)酵飼料和酶解飼料為代表的生物飼料是推行無(wú)抗養(yǎng)殖的有效手段，也是解決畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。大量研究表明，菌酶協(xié)同對(duì)飼料和飼料原料的作用效果優(yōu)于單獨(dú)的菌或酶處理效果，且前者在改善飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和飼喂效果方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。2018 年初發(fā)布的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《生物飼料產(chǎn)品分類》（T/CSWSL001—2018）將菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料定義使用飼料原料目錄和飼料添加劑品種目錄等國(guó)家相關(guān)法規(guī)允許使用的飼料原料、酶制劑和微生物，通過(guò)發(fā)酵工程和酶工程技術(shù)協(xié)同作用生產(chǎn)的單一飼料和混合飼料[1]。采用菌酶協(xié)同處理飼料一方面可提高發(fā)酵過(guò)程中微生物對(duì)飼料中大分子物質(zhì)的利用效率，改善飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并縮短發(fā)酵周期；另一方面，也可以利用某些菌種的抗菌作用改變動(dòng)物腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，增強(qiáng)動(dòng)物抵抗力，減少抗生素的使用[2]。因此，利用菌酶協(xié)同作用對(duì)于飼料資源尤其是非常規(guī)飼料資源的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用意義重大。本文綜述了菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料的分類和酵解機(jī)制，概括了菌酶協(xié)同發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)及其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)展，為其今后在養(yǎng)殖業(yè)中更廣泛地應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料

1.1 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料的分類 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料按照基質(zhì)種類差異可分為菌酶協(xié)同發(fā)酵蛋白飼料、菌酶協(xié)同發(fā)酵能量飼料和菌酶協(xié)同發(fā)酵粗飼料。菌酶協(xié)同發(fā)酵蛋白飼料的基質(zhì)主要為豆粕、大豆蛋白、菜籽粕和棉籽粕等；所用菌種為植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母等，具有清除植物飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的重要作用[3]；所用的酶以蛋白水解酶為主，用以分解蛋白基質(zhì)中的大分子蛋白質(zhì)，提高其消化率或提高特定功能肽含量[4]。菌酶協(xié)同發(fā)酵能量飼料的基質(zhì)包括谷物副產(chǎn)物、馬鈴薯渣等能量飼料；目前報(bào)道的菌種有假絲酵母、釀酒酵母、乳桿菌等，可提高飼料中蛋白質(zhì)含量、降低粗纖維含量，增加飼料的適口性[5]；酶類包括淀粉酶、纖維素酶等，用來(lái)降解飼料原料，將飼料中難降解組分轉(zhuǎn)化為容易被吸收的小分子物質(zhì)，從而提高飼料的吸收利用率[6]。菌酶協(xié)同發(fā)酵粗飼料的基質(zhì)包括玉米青貯飼料、玉米芯、玉米秸稈、棉花秸稈等；可用菌種包括地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌和酵母菌，用來(lái)去除木質(zhì)素，使纖維組織松散；可用酶種類以纖維素酶和木聚糖酶為主，用來(lái)酶解木質(zhì)纖維，提高酶解率和木聚糖產(chǎn)量[7-9]。

菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料按照飼料原料數(shù)目差異分為菌酶協(xié)同發(fā)酵單一飼料和菌酶協(xié)同發(fā)酵混合飼料。菌酶協(xié)同發(fā)酵單一飼料是僅以一種主要飼料原料作為底物，接種微生物進(jìn)行發(fā)酵獲得的飼料產(chǎn)品，常見(jiàn)菌酶協(xié)同發(fā)酵單一飼料有發(fā)酵豆粕、發(fā)酵玉米、發(fā)酵酒糟和發(fā)酵秸稈等[10-11]；菌酶協(xié)同發(fā)酵混合飼料是指以多種飼料原料作為底物進(jìn)行發(fā)酵得到的發(fā)酵飼料，基料的選擇需要考慮動(dòng)物所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類及其含量，同時(shí)應(yīng)創(chuàng)建發(fā)酵體系中微生物生長(zhǎng)所適宜的環(huán)境[12]。與單一飼料相比，發(fā)酵混合飼料營(yíng)養(yǎng)更均衡、適口性更好，與全價(jià)配合飼料的營(yíng)養(yǎng)組成更接近[13]。

此外，菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料還可按照微生物需氧程度分為好氧性菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料、厭氧性菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料和兼性厭氧菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料。其中，好氧菌酶協(xié)同發(fā)酵適用于單一原料的發(fā)酵，常用的發(fā)酵菌種為曲霉菌、芽孢桿菌、酵母菌等好氧或兼性厭氧菌[14]；厭氧菌酶協(xié)同發(fā)酵適用于單一或混合原料的發(fā)酵，常用的發(fā)酵菌種為乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌；而兼性厭氧菌酶協(xié)同發(fā)酵目前尚處于研發(fā)階段。

1.2 發(fā)酵和酶解作用及菌酶協(xié)同發(fā)酵機(jī)制 在發(fā)酵過(guò)程中，微生物能夠產(chǎn)生酶來(lái)酶解底物中的大分子物質(zhì)，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的抗原性，并通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)酸和抑菌物質(zhì)發(fā)揮其抑菌活性，維持動(dòng)物腸道穩(wěn)態(tài)，還能改善飼料的適口性，從而提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。但微生物發(fā)酵飼料存在菌株性能不穩(wěn)定、耐受性低、不易保存的問(wèn)題[15-17]。酶解法能夠特異性酶解底物和底物中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，在短時(shí)間內(nèi)破壞植物細(xì)胞壁，從而節(jié)省能量并促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，但酶解后會(huì)促使飼料產(chǎn)生苦澀味道，影響口感，且存在耐熱性差、成本較高、酶解不徹底等問(wèn)題[18]。在協(xié)同發(fā)酵體系中，酶能夠加速底物的分解，通過(guò)調(diào)節(jié)乳酸的生成和pH 的變化影響微生物的發(fā)酵效率[19-20]。菌種能夠降解底物并為酶解反應(yīng)提供分解后的小分子物質(zhì)，加快酶解反應(yīng)進(jìn)程，部分微生物還能夠生成相應(yīng)功能酶，與體系內(nèi)酶發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進(jìn)底物酵解過(guò)程[21]。近幾年的研究表明，菌酶協(xié)同發(fā)酵不僅可將飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子水解的更加徹底，縮短發(fā)酵周期，并且更有利于提高微生物的發(fā)酵效率，使發(fā)酵后的飼料存留大量益生菌，被家畜食用后可維持腸道穩(wěn)態(tài)[22]。

菌酶協(xié)同作用是微生物參與的生命活動(dòng)過(guò)程和酶參與的生物化學(xué)過(guò)程的有機(jī)結(jié)合，在協(xié)同過(guò)程中涉及到多種基質(zhì)、菌株和酶，菌株類型和發(fā)酵參數(shù)的改變均會(huì)對(duì)酶活產(chǎn)生影響。龔劍明等[23]利用黃孢原毛平革菌、香菇菌、蟲(chóng)擬蠟菌、槭射脈革菌4 種真菌分別接種油菜秸稈，發(fā)現(xiàn)香菇菌處理組錳過(guò)氧化物酶活性顯著高于其他3 組。Li 等[24]采用纖維素酶和酵母菌，分別在26、28、30、32、34℃下同步糖化發(fā)酵法制備飲料，發(fā)現(xiàn)在34℃下纖維素酶活性最高，對(duì)纖維素分解的促進(jìn)作用最強(qiáng)，飲料中酒精濃度最高。趙華等[25]研究發(fā)現(xiàn)，影響木薯渣發(fā)酵系統(tǒng)中羧甲基纖維素酶活的因素依次為發(fā)酵時(shí)間、初始pH、發(fā)酵溫度、料水比。此外，菌種和酶之間還存在著雙向影響關(guān)系，如菌種影響酶發(fā)揮最大活性時(shí)的pH，而酶又以通過(guò)改變pH 影響菌種發(fā)酵。Da Silva 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌生產(chǎn)的殼聚糖酶在pH為5.0 時(shí)表現(xiàn)出最大活性，而康氏木霉菌所產(chǎn)的殼聚糖酶在pH 為5.5 時(shí)活性最大。Nadeau 等[26]研究證明，纖維素水解酶能夠加快可溶性碳水化合物的轉(zhuǎn)化效率，減少降低發(fā)酵體系pH 的時(shí)間，進(jìn)而促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵，提高青貯飼料的發(fā)酵效率?？梢?jiàn)，只有合理考慮微生物和功能酶的合理配伍問(wèn)題，通過(guò)試驗(yàn)將發(fā)酵體系中的菌株和酶進(jìn)行篩選，找到最佳的配比并不斷優(yōu)化發(fā)酵條件，才有望實(shí)現(xiàn)發(fā)酵效率最大化。劉顯琦[22]研究發(fā)現(xiàn)，在用枯草芽孢桿菌和胃蛋白酶協(xié)同發(fā)酵制備低抗原性豆粕過(guò)程中，得到最佳的發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間17.52 h、酶解時(shí)間88.2 min、酶添加量0.825%，此時(shí)豆粕中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白抗原性在6～12 h 的降解速率最高，這可能與枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線有關(guān)。毛銀等[27]在選取產(chǎn)酸和分解蛋白能力較強(qiáng)的植物乳桿菌DY6 為發(fā)酵菌種后，對(duì)比了酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶分解大分子蛋白的能力，最終選取植物乳桿菌DY6 和中性蛋白酶為處理菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕飼料的菌酶組合，且發(fā)現(xiàn)體系中小肽含量隨菌液接種量和加酶量的上升而提高，在菌液接種量為5%、加酶量為1 250 U/g 時(shí)趨于穩(wěn)定。需要注意的是，發(fā)酵菌株的選擇和種類差異直接影響了菌酶協(xié)同體系中最終酵解工藝的選擇。

2 菌酶協(xié)同發(fā)酵效果

2.1 提高發(fā)酵效率，縮短發(fā)酵周期 在發(fā)酵體系中添加相應(yīng)的水解酶有利于提高產(chǎn)物的產(chǎn)量并縮短發(fā)酵時(shí)間，且酶解反應(yīng)能夠促進(jìn)有益菌增殖，改善微生物發(fā)酵效果。劉江英等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在益生菌混合發(fā)酵體系中添加0.2、0.4、0.8 g/kg 的酸性蛋白酶，發(fā)現(xiàn)不同劑量水平的酸性蛋白酶均能夠加快發(fā)酵進(jìn)程，縮短發(fā)酵周期，即在相同時(shí)間內(nèi)，體系內(nèi)芽孢桿菌和乳酸菌繁殖數(shù)量較空白組明顯增加，其中乳酸菌最高可增加11.74%。Su 等[29]研究表明，與益生菌具有協(xié)同作用的外源蛋白酶能夠在2 d 內(nèi)提升近1 CFU 發(fā)酵豆粕中有益菌的存活率，并且加速大豆蛋白的降解率。微生物和功能酶之間的協(xié)同作用也是提高發(fā)酵效率的重要因素。Nadeau 等[26]研究證明，纖維素水解酶能夠作為發(fā)酵體系的激活劑，可促進(jìn)纖維降解和乳酸菌發(fā)酵，與對(duì)照組相比可降低青貯飼料中17%半纖維素，提高青貯飼料的發(fā)酵效率。

2.2 加速底物降解，促進(jìn)原料利用 在菌酶協(xié)同發(fā)酵體系中，菌株本身對(duì)底物具有高效降解能力，通過(guò)發(fā)酵還能夠促進(jìn)酶的活力，使整個(gè)體系的水解能力進(jìn)一步提升，從而提高底物的降解程度和飼料原料的利用率[30]。Liu 等[31]研究報(bào)道，玉米秸稈生產(chǎn)蛋白飼料的最佳發(fā)酵劑為纖維素酶和酵母菌混合物，且酶和菌的發(fā)酵比例為8:15，發(fā)酵48 h 后發(fā)酵飼料的粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)29.71%，較未發(fā)酵組提高了4.67 倍。Muck 等[32]在青貯飼料中添加布式乳桿菌，乳酸能夠緩慢轉(zhuǎn)化為乙酸和1,2-丙二醇，提高了青貯飼料的有氧穩(wěn)定性；而將纖維素酶和半纖維素酶添加到青貯飼料中，植物細(xì)胞壁被快速分解，青貯飼料發(fā)酵程度增強(qiáng)的同時(shí)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也得到提高。張煜等[33]通過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)篩選了能夠高效降解抗原蛋白的枯草芽孢桿菌BS12 和產(chǎn)乳酸能力較強(qiáng)的糞腸球菌EF，將兩者按菌量比8:1 接種，同時(shí)加入1%的復(fù)合酶制劑（纖維素酶、甘露糖酶和果膠酶），固態(tài)發(fā)酵后檢測(cè)到飼料的中性洗滌纖維降解率超過(guò)40%，粗蛋白質(zhì)消化率提高近7%。林芝等[12]研究發(fā)現(xiàn)，將綠汁發(fā)酵液和木聚糖酶、纖維素酶進(jìn)行復(fù)合添加，一方面能夠有效分解巨菌草細(xì)胞壁，降低粗纖維含量，還能夠促進(jìn)乳酸發(fā)酵，提高青貯飼料中的碳水化合物含量，并增加干物質(zhì)回收率，使青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到改善。與酶或菌單獨(dú)處理相比，菌酶協(xié)同處理提高底物利用率上更有優(yōu)勢(shì)。Li 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，狼尾草青貯酶解過(guò)程中應(yīng)用可分解纖維素的微生物可顯著提高底物碳水化合物利用率，其中里氏木霉和糞腸球菌對(duì)于底物中葡萄糖和木糖的促進(jìn)作用最為顯著。Colombatto 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，酶混合物可以提高發(fā)酵罐中青貯飼料的中性洗滌纖維降解率，在高pH 和低pH 環(huán)境下可分別提高43%、25%。

2.3 降低抗?fàn)I養(yǎng)因子水平，改善飼料品質(zhì) 植物性飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子水平是影響其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和代謝利用率的一個(gè)重要因素，而通過(guò)菌酶協(xié)同發(fā)酵技術(shù)能夠有效降低植物原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子和毒素的含量。豆粕是動(dòng)物飼料中主要的植物蛋白來(lái)源，豆粕中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，直接阻礙了大豆蛋白質(zhì)的消化吸收，降低了飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，影響了動(dòng)物生長(zhǎng)性能[29]。近年來(lái)，外源酶補(bǔ)充劑已廣泛應(yīng)用于益生菌發(fā)酵豆粕中，用以消除豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子并促進(jìn)大豆蛋白質(zhì)的降解[36]。張煜等[33]在總菌量為1×107CFU/g 的枯草芽孢桿菌和乳酸菌混合菌中添加0.5%的復(fù)合酶制劑，固態(tài)發(fā)酵72 h 后飼料中大豆球蛋白和β-伴球蛋白的降解率均達(dá)到80%以上。劉顯琦等[22]研究發(fā)現(xiàn)，豆粕在枯草芽孢桿菌和胃蛋白酶協(xié)同發(fā)酵后，其大豆球蛋白和β-伴球蛋白的最大降解率可以分別達(dá)到78.6%和40.5%。菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕降低豆粕抗原的效果好于菌和酶單獨(dú)處理。菌酶協(xié)同協(xié)同發(fā)酵不僅可以將豆粕中的大豆抗原蛋白水解的更加徹底，還可以彌補(bǔ)微生物單一處理后產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定的不足，提高飼料的適口性，并使其在進(jìn)入動(dòng)物腸道后還可以發(fā)揮維持腸道穩(wěn)態(tài)的作用[22]。

3 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 豬 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料有利于提高豬的生長(zhǎng)性能，同時(shí)對(duì)豬的腸道健康也有著明顯改善作用。張煜等[33]研究表明，與抗生素組相比，使用混菌（枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和乳酸菌）和復(fù)合酶制劑處理的玉米-豆粕型菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料替代10% 的基礎(chǔ)日糧后，斷奶仔豬的耗料增重比和腹瀉率無(wú)明顯差異，而平均日增重和采食量卻明顯提高，生產(chǎn)性能有所改善。Huang 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合益生菌和霉菌毒素降解酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵飼料對(duì)豬空腸上皮細(xì)胞的活力有協(xié)同促進(jìn)作用，減緩霉菌毒素對(duì)腸上皮細(xì)胞的毒性，促進(jìn)緊密連接蛋白和B淋巴細(xì)胞瘤-2 的表達(dá)，從而抑制了腸上皮細(xì)胞的凋亡。馮江鑫等[38]研究發(fā)現(xiàn)，菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料能夠顯著提高干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率；使仔豬十二指腸隱窩深度從425.38 μm 降低至336.92 μm，絨毛高度從433.44 μm 提高至540.39 μm，空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量增加至9.53 個(gè)，回腸絨毛高度增加至426.71 μm；與對(duì)照組相比，菌酶協(xié)同飼料飼喂組仔豬的空腸封閉蛋白-1 和閉合小環(huán)蛋白-1 以及回腸閉合蛋白表達(dá)量均增加約1 倍；將對(duì)照組24.40%的腹瀉率降低至6.55%，改善了仔豬腸道健康和生長(zhǎng)性能。

3.2 雞 菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料能夠促進(jìn)雞腸上皮細(xì)胞的形成，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，維持腸道微生態(tài)平衡，改善雞的腸道健康并預(yù)防腸道病原菌感染[39]。Goodarzi等[40]給肉雞飼喂菌酶協(xié)同發(fā)酵的豌豆飼料，當(dāng)菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料添加到300 g/kg 時(shí)，其回腸粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的消化率得到改善，飼料轉(zhuǎn)化率提高。此外，菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料對(duì)肉雞的免疫功能也有調(diào)控作用。Yeong等[41]研究表明，在日糧中添加10%的枯草芽孢桿菌和蛋白酶協(xié)同發(fā)酵飼料可促進(jìn)肉雞β-伴球蛋白的α和β亞基的分解，降低肉雞血清中大豆過(guò)敏原抗體IgG 水平，抑制肉雞的過(guò)敏性免疫反應(yīng)，從而改善肉雞的免疫功能。另有研究證明，益生菌和酶的混合培養(yǎng)物能夠促進(jìn)肉雞對(duì)禽流感病毒和新城疫病毒的免疫反應(yīng)，提高淋巴器官-脾臟的重量，降低抗體滴度[42]。

3.3 其他動(dòng)物 目前，菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料在反芻等其他動(dòng)物飼養(yǎng)中的研究相對(duì)較少，其應(yīng)用效果主要體現(xiàn)在提高腸道消化率和改善生長(zhǎng)性能等方面。拉加[43]研究表明，用多酶益生素噴灑青稞秸稈，發(fā)酵2～3 d 后飼喂羔羊能夠提高采食量、飼料轉(zhuǎn)化率和增重等生長(zhǎng)性能，且對(duì)降低飼料成本有一定作用。李遠(yuǎn)林等[44]將木薯渣先經(jīng)淀粉酶和纖維素酶雙酶解處理后，用酵母菌和霉菌混菌種發(fā)酵，得到了一類菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料，在處理過(guò)程中產(chǎn)生了大量微生物菌體蛋白及其他有用的代謝產(chǎn)物，含有多種消化酶和促營(yíng)養(yǎng)分子，能夠提高羊的抗病能力并促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。

4 小 結(jié)

微生物和酶之間有著很好的協(xié)同作用，不僅可以加速大分子物質(zhì)的降解、提高微生物的發(fā)酵效率、降低抗?fàn)I養(yǎng)因子水平，還能改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能和免疫機(jī)能，特別是在維持畜禽腸道健康方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。然而，菌酶協(xié)同作用是微生物參與的生命活動(dòng)過(guò)程和酶參與的生物化學(xué)過(guò)程的有機(jī)結(jié)合，在協(xié)同過(guò)程中涉及到多種基質(zhì)、菌種和酶，其機(jī)理極其復(fù)雜，絕不是簡(jiǎn)單的生物處理工藝所能實(shí)現(xiàn)的，需充分考慮添加的菌酶種類的特性，以確定為達(dá)到最佳酵解所需的菌酶接種比、料水比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等。菌酶協(xié)同過(guò)程中所用菌種的規(guī)范性和工藝質(zhì)量的穩(wěn)定性有待更深入地研究，全面提高生物技術(shù)水平并加快發(fā)酵飼料的標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)，以更好地將菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料進(jìn)行全面應(yīng)用和推廣。