侯瑞英， 吳冬梅， 焦偉杰， 汪 坤， 杜 蕾， 吳桂月， 韓 競(jìng)， 趙 旭

（河南省中醫(yī)院藥學(xué)部，河南鄭州450002）

近些年，由營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩造成的代謝相關(guān)疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)急劇上升趨勢(shì)［1］。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）和非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）均是常見(jiàn)的代謝性疾病，且二者關(guān)系密切。二者通常共存，約60%～70%的T2DM 患者中發(fā)生肝脂肪變性，特別是腹型肥胖T2DM 患者可高達(dá) 100%［2］；約 40% 的 NAFLD 患者同時(shí)患有 T2DM［3］。T2DM 不僅是導(dǎo)致 NAFLD 發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一，且其能加快NAFLD 進(jìn)展至非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），并增加發(fā)生肝硬化和肝細(xì)胞癌的患病風(fēng)險(xiǎn)［4］；另外，在發(fā)生肝脂肪變性的T2DM 患者中，加劇的胰島素抵抗（insulin resistance，IR）使得T2DM 患者的血糖更難控制，從而增加糖尿病并發(fā)癥的患病風(fēng)險(xiǎn)［5］。目前，關(guān)于T2DM 和NAFLD 的管理策略均包含降糖、降脂、胰島素增敏劑、減肥、控制飲食和有氧運(yùn)動(dòng)等［6-7］。但，二者共存使的疾病的進(jìn)展更加復(fù)雜，造成這些策略的有效性明顯降低。因此，研究T2DM 和NAFLD特別是二者合并癥的治療策略尤為緊迫。

毛蕊異黃酮（calycosin，CAL）是黃芪中一種具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和調(diào)節(jié)糖脂代謝等藥理活性的異黃酮化合物［8］。已有研究表明，CAL能通過(guò)抑制炎癥并增強(qiáng)胰島β 細(xì)胞功能，來(lái)減輕妊娠糖尿?。?］。而，CAL 在T2DM/NAFLD 合并癥模型大鼠中的作用及其機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過(guò)高糖-高脂飲食誘導(dǎo)并聯(lián)合鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）注射的方法建立T2DM 模型大鼠，觀察CAL 干預(yù)對(duì)NAFLD的影響，并探討其潛在的作用機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 45 只 6 周齡 SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠（180～190 g）購(gòu)于河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［（生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（豫）2017－0001］，飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物房。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的所有相關(guān)過(guò)程均得到本單位動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑（盒）與抗體 STZ 和CAL 購(gòu)自Sigma；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒及大鼠 IL-6、IL-1β 和 TNF-α ELISA 試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；大鼠血糖和胰島素ELISA 試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；HE 試劑盒、油紅O試劑盒和HRP 偶聯(lián)的山羊抗兔IgG II 抗購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；Lamin B1 和β-actin 購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol 試劑、RIPA 緩沖液、細(xì)胞核/質(zhì)蛋白分離試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒和ECL 試劑均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；核因子 κB p65（nuclear factor-kappa B p65，NF-κB p65）、胰島素受體底物 1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）、p-IRS-1（Ser307）、AKT 和 p-AKT（Ser473）抗體均購(gòu)自CST。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)方案 SD 大鼠在給予特殊飲食之前，先用普通飼料（normal chow diet，NCD）適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。按照文獻(xiàn)［10-12］方法，通過(guò)高脂高糖飲食（high fat-high sugar diet，HFSD）持續(xù)喂養(yǎng)方案聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）法構(gòu)建T2DM大鼠。方法描述：先將大鼠先分為NCD 飼養(yǎng)（n=14）組和高脂-高糖飼料（high fat-high sugar diet，HFSD組；HFSD 由66.5%NCD、10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇和1%膽酸鈉組成）飼養(yǎng)組（n=31），飼養(yǎng)5 周后，HFSD 組大鼠給予腹腔注射50 mg/kg STZ（0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液配置，pH 4.3），NCD 組大鼠給予等體積檸檬酸緩沖液注射；注射后3 d，將空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平＞200 mg/dL 的HFSD組大鼠進(jìn)一步隨機(jī)分為模型（model）組及model+低、中和高劑量CAL 組，每組7 只大鼠，用HFSD 飼養(yǎng)16周；其中model+低、中和高劑量CAL組大鼠通過(guò)灌胃方式分別給藥10、20 和 40 mg/kg CAL（CAL 劑量參考文獻(xiàn)［13-14］），每天 1 次，持續(xù) 16 周；NCD 組大鼠分為正常對(duì)照（normal control，NC）組（n=7）和NC+高劑量（40 mg/kg）CAL組（n=7），用NCD飼料飼養(yǎng)16周。

2.2 血清生化測(cè)定 給藥方案結(jié)束后，對(duì)大鼠禁食過(guò)夜，通過(guò)眼眶后靜脈叢穿刺采血以收集血液。4 ℃下1 207×g離心15 min 收集血清。用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中 TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT 和 AST 水平。用ELISA 法檢測(cè)血清中FBG 和胰島素水平，然后計(jì)算IR 穩(wěn)態(tài)指數(shù)（homeostasis assessment of insulin resistance index，HOMA-IR），計(jì)算公式HOMA-IR=FBG（mmol/L）×胰島素（mU/L）÷22.5。

2.3 組織學(xué)分析 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，分離出肝臟。將肝組織用標(biāo)準(zhǔn)程序的梯度乙醇和二甲苯中處理后，用石蠟包埋。將石蠟包埋的肝組織切為6 μm 厚的連續(xù)切片。切片脫蠟水化后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別進(jìn)行HE 和油紅O 染色。并根據(jù)HE 染色情況計(jì)算肝脂肪變性程度和NAFLD 活動(dòng)評(píng)分（NAFLD activity score，NAS），根據(jù)油紅O 染色情況計(jì)算肝脂沉積程度。

2.4 肝組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平測(cè)定 取新鮮的肝組織，在4 ℃下用RIPA 勻漿后，首先，取勻漿液用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度；其次，取勻漿液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，用ELISA 法檢測(cè)勻漿液中IL-6、IL-1β和TNF-α 含量，然后根據(jù)測(cè)定的肝組織中蛋白濃度，將其換算成肝組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

2.5 Western blot 分析 取新鮮的肝組織，分別用RIPA 和細(xì)胞核/質(zhì)蛋白分離試劑盒對(duì)組織進(jìn)行勻漿，并分離總蛋白、細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白。用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定組織勻漿的蛋白質(zhì)濃度后，將每樣本含等量（50 mg）蛋白的組織勻漿液進(jìn)行SDS-PAGE，并將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用含5%脫脂奶粉的PBS-T 溶液封閉膜2 h 后，將膜與 I 抗 NF-κB p65（1∶4 000 稀釋）、IRS-1（1∶2 000 稀釋）、p-IRS-1（Ser307）（1∶1 000 稀釋）、AKT（1∶2 500稀釋）、p-AKT（Ser473）（1∶800 稀釋）、β-actin（1∶5 000稀釋）和Lamin B1（1∶3 000稀釋）抗體在室溫下孵育2 h；洗滌后，將膜與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（1∶2 000 稀釋）在室溫下孵育1 h，用ECL 試劑曝光顯像，并使用Quantity One軟件分析條帶光密度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析。多組之間比較選擇單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較選用LSD 法事后多重比較。P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1 CAL對(duì)T2DM大鼠糖脂代謝參數(shù)的影響

表1 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠FBG 水平、胰島素水平、HOMA-IR 值、TG 水平、TC 水平和LDL-C 水平均顯著增加（P＜0.01），HDL-C 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，模型+低、中和高劑量CAL組中上述糖脂代謝參數(shù)均發(fā)生明顯改善（P＜0.05，P＜0.01），其中高劑量 CAL 的效果尤為顯著（P＜0.01）。

表1 各組大鼠糖脂代謝參數(shù)的比較Table 1. Comparison of metabolic parameters in each group（Mean±SD. n=7）

2 CAL對(duì)T2DM大鼠肝臟的組織學(xué)的影響

肉眼觀察結(jié)果（圖1A）顯示，正常對(duì)照組和正常對(duì)照+高劑量CAL組肝臟光滑鮮亮；模型組肝臟粗糙發(fā)黃有油膩感；模型+低、中和高劑量CAL 組肝臟外觀隨著CAL 劑量增加，逐漸光滑鮮亮。HE 染色觀察結(jié)果（圖1B）顯示，正常對(duì)照組和正常對(duì)照+高劑量CAL 組肝組織中肝細(xì)胞正常；模型組肝組織的肝細(xì)胞呈現(xiàn)大量大泡性脂肪變性和氣球樣變；模型+低、中和高劑量CAL組的肝組織的肝細(xì)胞隨著CAL劑量增加，脂肪變性和氣球樣變逐漸改善，其中高劑量CAL 組僅存在少量小泡性脂肪變性和氣球樣變。油紅O 染色觀察結(jié)果（圖1C）顯示，正常對(duì)照組和正常對(duì)照+高劑量CAL組肝組織中僅存在微量紅染；模型組肝組織呈現(xiàn)大面積紅染，且紅色脂滴匯合成大泡性脂滴；模型+低、中和高劑量CAL 組的肝組織隨著CAL劑量增加，紅染程度逐漸降低。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組NAS積分以及肝脂肪變性和肝脂沉積程度均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，模型+低、中和高劑量CAL 組肝組織中上述病理形態(tài)參數(shù)均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），其中高劑量CAL的效果尤為顯著（P＜0.01）。

表2 各組肝組織病理形態(tài)參數(shù)的比較Table 2. Comparison of hepatic histopathological parameters in each group（Mean±SD. n=7）

Figure 1. Visual morphology and histological images of livers in each group. A：representative visual morphology of livers；B：representative HE staining images of liver tissues；C：representative Oil red O staining images of liver tissues. The scale bar=100 μm.圖1 各組肝臟的肉眼外觀以及肝組織學(xué)圖像

3 CAL對(duì)T2DM大鼠肝損傷的影響

結(jié)果（表2）顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組血清 ALT 和 AST 以及肝組織中 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，模型+低、中和高劑量CAL組肝組織中上述肝損傷參數(shù)均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），其中高劑量CAL 的效果尤為顯著（P＜0.01）。

4 CAL 對(duì) T2DM 大鼠肝組織中 p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）表達(dá)及NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的影響

表3 各組肝損傷參數(shù)比較Table 3. Comparison of liver injury parameters in each group（Mean±SD. n=7）

結(jié)果（圖2、表4）顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組肝組織中p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）及細(xì)胞核NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，模型+低、中和高劑量CAL 組肝組織中p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）及細(xì)胞核NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），其中高劑量 CAL 的效果尤為顯著（P＜0.01）。

Figure 2. Expression of p-IRS-1（Ser307）and p-Akt（Ser473）and nuclear translocation of NF-κB p65 in liver tissues were detected by Western blot. A：representative bands of p-IRS-1（Ser307）expression；B：representative bands of p-Akt（Ser473）expression；C：representative bands of nuclear NF-κB p65 and cytopasmic NF-κB p65 expressions.圖2 Western blot檢測(cè)肝組織中p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）表達(dá)及NF-κB p65核轉(zhuǎn)位

表4 各組肝組織中p-IRS-1（Ser307）和p-Akt（Ser473）及細(xì)胞核NF-κB p65和細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較Table 4. Comparison of the relative expression levels of p-IRS-1（Ser307），p-Akt（Ser473），nuclear NF-κB p65 and cytopasmic NF-κB p65 proteins in liver tissues in each group（Mean±SD. n=7）

討 論

糖脂代謝穩(wěn)態(tài)失衡不僅是NAFLD 的伴發(fā)現(xiàn)象，也是驅(qū)動(dòng)肝脂肪變性重要的因素。已有報(bào)道表明，IR、TC、TG 和 LDL-C 水平持續(xù)異常升高和 HDL-C 水平持續(xù)異常降低能加重T2DM 模型小鼠的肝脂肪變性［15］。此外，肝脂肪變性能增加肝細(xì)胞對(duì)促炎介質(zhì)的敏感性，且持續(xù)的慢性炎性反應(yīng)能加劇肝損傷［16-17］。 本 研 究 結(jié) 果 顯 示 ，CAL 對(duì) HFSD 喂 養(yǎng) 的T2DM 模型大鼠具有抑制IR、維持糖脂代謝穩(wěn)態(tài)、改善肝脂肪變性并減輕肝損傷的藥理作用，這些數(shù)據(jù)表明CAL 能減輕T2DM 模型大鼠肝臟的NAFLD 病變，提示CAL 可能是潛在是用于預(yù)防T2DM 發(fā)生NAFLD病變的藥物。

為探討CAL 抑制T2DM 模型大鼠肝損傷的機(jī)制，本研究進(jìn)一步分析了影響炎性反應(yīng)中的經(jīng)典信號(hào) NF-κB 的活性。有報(bào)道［18］稱，HFSD 可激活肝組織中 NF-κB 信號(hào)，并通過(guò) NF-κB 信號(hào)介導(dǎo)的炎性反應(yīng)而加快NAFLD 的進(jìn)展。抑制NF-κB 信號(hào)活性可減少促炎介質(zhì)的生成和減輕肝損傷，從而達(dá)到減緩NAFLD 的進(jìn)展的作用［19］。本研究結(jié)果表明，CAL 能降低HFSD 喂養(yǎng)的T2DM 模型大鼠肝組織中NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，說(shuō)明CAL能減弱肝組織中NF-κB信號(hào)活性，提示CAL 可能通過(guò)負(fù)調(diào)控NF-κB 信號(hào)活性來(lái)控制肝臟炎性反應(yīng)和肝損傷。

此外，IR 是 T2DM 和 NAFLD 共同的起始因素之一，其與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙有關(guān)［20］。胰島素在調(diào)節(jié)糖脂穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。IRS-1 是胰島素受體的主要效應(yīng)器，負(fù)責(zé)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)胰島素與胰島素受體結(jié)合時(shí)，IRS-1 的Ser307 位點(diǎn)磷酸化能阻斷胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致IR；而降低IRS-1 的Ser307位點(diǎn)磷酸化水平能恢復(fù)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制IR［21］。PI3K/Akt 信號(hào)是響應(yīng)胰島素信號(hào)的 IRS-1 最重要的下游信號(hào)之一［21-25］。當(dāng) IRS-1 的 Ser307 位點(diǎn)磷酸化后，活化的IRS-1 能激活PI3K，PI3K 活化能使細(xì)胞質(zhì)膜產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3 與磷脂酰肌醇依賴激酶 2（PDK2）結(jié)合磷酸化 Akt 的 Ser473（也稱Akt1），激活 Akt［22］。Akt 活化能通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUTs）轉(zhuǎn)座和GSK3β 等多種途徑調(diào)控糖脂代謝［23-24］。且研究［22-23，25］表明，抑制 Akt 的 Ser473 位點(diǎn)磷酸化后，T2DM 模型大鼠表現(xiàn)為胰島素敏感性增加和肝損傷降低。本研究顯示，CAL能抑制HFSD喂養(yǎng)的T2DM 模型大鼠肝組織中IRS-1 的Ser307 位點(diǎn)磷酸化和Akt 的Ser473 位點(diǎn)磷酸化，提示CAL 可以通過(guò)恢復(fù)T2DM 大鼠胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)降低IR 和維持糖脂代謝穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，CAL 能抑制 HFSD 喂養(yǎng)的 T2DM 模型大鼠的IR、改善肝脂肪變性和肝脂蓄積并減輕肝損傷，且這些作用可能與其恢復(fù)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和減弱NF-κB信號(hào)活性有關(guān)。