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氟維司群細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)研究

2021-12-06 09:13:11王以云王秀艷段春艷
科技信息·學(xué)術(shù)版 2021年29期

王以云 王秀艷 段春艷

摘要:目的:建立氟維司群細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。方法:按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠檢查法的要求,采用兩個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn),并對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)果:氟維司群用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和二甲基亞砜溶解成10mg·ml-1的溶液稀釋至80倍時(shí),對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無(wú)干擾。結(jié)論:可采用此法對(duì)氟維司群的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢查。

關(guān)鍵詞:氟維司群;細(xì)菌內(nèi)毒素;凝膠法;干擾試驗(yàn)

內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖,極微量(1ng/kg)的內(nèi)毒素進(jìn)入人體即可引起發(fā)熱反應(yīng)。大劑量的內(nèi)毒素可引起機(jī)體發(fā)生內(nèi)毒素休克、彌散性血管內(nèi)凝血、多器官衰竭等反應(yīng),甚至導(dǎo)致死亡。故注射劑中內(nèi)毒素內(nèi)毒素含量應(yīng)嚴(yán)格控制,生產(chǎn)注射劑所使用的原料中內(nèi)毒素的含量也應(yīng)進(jìn)行控制,以保證注射劑的安全性。

氟維司群是一種抗腫瘤藥,屬于競(jìng)爭(zhēng)性雌激素受體拮抗劑,可阻斷雌激素的作用而本身沒(méi)有激動(dòng)受體作用。主要用于絕經(jīng)后(包括自然絕經(jīng)和人工絕經(jīng))婦女在抗雌激素輔助治療后或過(guò)程中復(fù)發(fā)、或在抗刺激素治療期間疾病進(jìn)展的雌激素受體陽(yáng)性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌。本研究對(duì)氟維司群細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的可行性進(jìn)行方法學(xué)研究,為該原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查提供依據(jù)。

1、儀器與材料

1.1實(shí)驗(yàn)材料

鱟試劑,靈敏度為0.06EU·ml-1,規(guī)格:0.1ml,批號(hào)2003252,湛江安度斯生物有限公司,批號(hào)19090412,福州新北生化工業(yè)有限公司;細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品,效價(jià)9000EU·支-1,批號(hào)150800-201601,廠家中國(guó)食品藥品檢定研究院;細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水50ml·瓶-1,批號(hào):1910100,湛江安度斯生物有限公司;二甲基亞砜,批號(hào)200227,西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2儀器

GZX-9246MBE電熱恒溫干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),XW-80A型漩渦混合器(上海滬西分析儀器廠有限公司),HH-8型恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司),XSR204型萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多),移液器(賽托利斯)。

1.3樣品

氟維司群,批號(hào):633200201、633200301、633200302,山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司。

2、方法與結(jié)果

2.1菌內(nèi)毒素限值的確定

根據(jù)企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn),確定原輔料的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(總細(xì)菌內(nèi)毒素之和小于制劑限度)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定:每1mg氟維司群中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.5EU·mg-1。

2.2鱟試劑靈敏度復(fù)核

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定,進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核,結(jié)果見(jiàn)表1。兩批鱟試劑經(jīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品檢查,λc與λ均一致,結(jié)果均復(fù)核規(guī)定。

2.3最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算

氟維司群供試品溶液的配制:稱(chēng)取供試品100mg,加入1mlBET水,再加入9ml的二甲基亞砜,混勻溶解既得C=10mg·ml-1的供試品溶液。

最大有效稀釋倍數(shù)(Maximum valid dilution,MVD)MVD= CL/λ為根據(jù),C為供試品溶液濃度10mg·ml-1,L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值0.5EU·mg-1,λ為鱟試劑的靈敏度0.06EU·ml-1,則MVD=83倍。

2.4干擾實(shí)驗(yàn)

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法,用兩個(gè)廠家標(biāo)示靈敏度為0.06EU·ml-1的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)。根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算MVD=83倍,方便樣品的稀釋及干擾實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的加入,選擇80倍進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

稱(chēng)取供試品100mg,共稱(chēng)取四份,每份分別加入1ml含100EU/ml、50EU/ml、25EU/ml、12.5EU/ml標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液,每份再分別加入9ml的二甲基亞砜,溶解混勻后每份溶液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋10倍、20倍、40倍、80倍制成含內(nèi)毒素濃度為0.125、0.06、0.03、0.015EU·ml-1的供試品溶液。每份供試液稀釋10倍時(shí)產(chǎn)生絮狀沉淀,靜置沉淀取水相進(jìn)行下一步稀釋。

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成濃度為0.125、0.06、0.03、0.015EU·ml-1的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液;同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照。根據(jù)公式antilg(∑X/4)分別計(jì)算出內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和含供試品的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

從以上干擾結(jié)果,內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值均在0.5λ~2λ之間,含供試品的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值均在0.5λ~2λ之間,80倍供試液對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)無(wú)干擾作用。

2.5供試品內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果

將三批供試品分別稱(chēng)取100mg,加入1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水,再加入9ml的二甲基亞砜,溶解混勻后用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋10倍、20倍、40倍、80倍制成供試品溶液;供試液稀釋10倍時(shí)產(chǎn)生絮狀沉淀,靜置沉淀取水相進(jìn)行下一步稀釋。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法,進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,結(jié)果見(jiàn)表3。三批供試品細(xì)菌內(nèi)毒素均符合規(guī)定,即內(nèi)毒素含量小于0.5EU·mg-1。

3、討論

細(xì)菌內(nèi)毒素隨注射劑進(jìn)入人體血液所導(dǎo)致的“熱源反應(yīng)”是注射劑臨床應(yīng)用中發(fā)生率較高的不良反應(yīng),細(xì)菌內(nèi)毒素是注射劑質(zhì)量檢查的重要項(xiàng)目。氟維司群作為注射劑原料,從生產(chǎn)源頭控制細(xì)菌內(nèi)毒素。本文按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法—凝膠法”進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究,結(jié)果表明氟維司群用溶劑溶解混勻后,稀釋80倍時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無(wú)干擾作用,可在大于或等于此稀釋倍數(shù)下采用凝膠法進(jìn)行氟維司群的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,從而控制供試品的內(nèi)毒素含量在限值范圍內(nèi),保證產(chǎn)品質(zhì)量,確保患者用藥安全。

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