郭思凡，曹 杰

中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193

0 引言

新生犢牛在胎兒時期無法通過胎盤獲得母源抗體，出生后需通過初乳獲得被動免疫，此階段犢牛免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，易受各種病原侵襲而發(fā)生腹瀉、肺炎等疾病[1]。預防性使用抗生素可能造成犢牛腸道菌群失調(diào)、生長緩慢，也會增加耐藥風險。黃芪多糖是中藥黃芪的提取物，能刺激機體產(chǎn)生免疫細胞，增強吞噬細胞功能，快速殺滅病原菌，從多通路上提高犢牛免疫力[2，3]。銀黃可溶性粉是金銀花和黃芩提取物，主成分為黃芩苷和綠原酸，可干擾病原微生物的復制表達代謝，具有解熱、止咳平喘的作用，對呼吸系統(tǒng)疾病有很好的抑制作用[4]。且黃芪多糖和銀黃可溶性粉沒有耐藥風險。本試驗的目的在于，探索黃芪多糖和銀黃聯(lián)用對新生犢牛免疫力及發(fā)病的影響，為犢牛疾病預防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃芪多糖粉，北京生泰爾生物科技有限公司生產(chǎn)，獸藥字050325236；銀黃可溶性粉，北京生泰爾生物科技有限公司生產(chǎn)，獸藥字050325229。

免疫球蛋白G（IgG）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，購自比利時Bio-X Diagnostics公司；白細胞介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、CD3分子、CD4分子、CD8分子酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒，購自上海江萊生物科技有限公司。

Cence離心機CL5，購自凱達湘儀離心機廠；HT312醫(yī)用折光儀，購自ATC公司；MK3酶標儀，購自Thermo公司。

1.2 試驗動物及處理

試驗分兩階段進行，I期試驗在河北首農(nóng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有限公司進行，II期試驗選擇新生犢牛發(fā)病率較高的河北某牧場進一步驗證。兩次試驗各選擇40頭體重相近、健康狀態(tài)良好的1 日齡荷斯坦母犢納入試驗，隨機分為試驗組和對照組，每組20 頭。試驗組犢牛自出生起，每天隨奶投服黃芪多糖5 g、銀黃可溶性粉3 g，每天1 次，連續(xù)給藥7 天。對照組犢牛不給藥，其他飼養(yǎng)條件一致。

1.3 數(shù)據(jù)收集及分析

自出生起連續(xù)觀察記錄兩組犢牛21 天內(nèi)健康狀況。按照美國威斯康辛大學犢牛健康評分表打分，記錄犢牛腹瀉、肺炎發(fā)生情況，如耳號、癥狀持續(xù)時間和死亡數(shù)，計算發(fā)病率、發(fā)病群體平均評分和死亡率。在給藥第7天時，I期試驗40 頭犢牛采血，血清總蛋白使用醫(yī)用折光儀檢測，血清IgG、IL-2、TNF-α、CD3、CD4、CD8使用ELISA試劑盒檢測。

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，結果用平均數(shù)±標準差表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 新生犢牛發(fā)病及死亡情況分析

I期試驗兩組新生犢牛均未發(fā)生肺炎，腹瀉分1～7 天、8～21 天兩階段統(tǒng)計。兩階段內(nèi)試驗組新生犢牛腹瀉發(fā)生率均顯著低于對照組（P＜0.05）；試驗1～7 天發(fā)病評分，試驗組與對照組相同，8～21天，試驗組低于對照組，但差異不顯著（表1）。試驗組8～21 天發(fā)病率較1～7 天提高5%，對照組8～21天發(fā)病率較1～7 天提高25%。試驗組8～21 天發(fā)病評分較1～7 天無變化，對照組8～21 天發(fā)病評分較1～7 天提高0.18（表1）。從腹瀉犢牛具體評分上看，試驗1～7 天兩組腹瀉犢牛評分均為2分，8～21天，試驗組腹瀉犢牛評分均為 2 分，而對照組有50%的腹瀉犢牛為2 分，50%的腹瀉犢牛為 3 分，表明試驗組犢牛腹瀉發(fā)生嚴重程度輕于對照組犢牛（表2）。從腹瀉持續(xù)時間上看，試驗1～7 天，試驗組犢牛腹瀉持續(xù)時間為3～4 天，對照組均為4 天及以上；8～21 天，試驗組犢牛腹瀉持續(xù)時間均為3 天，對照組持續(xù)3 天的犢牛僅占40.0%（表3）。

表1 試驗期間犢牛腹瀉發(fā)生情況

表2 試驗期間腹瀉犢牛評分情況 單位：頭

表3 試驗期間犢牛腹瀉持續(xù)時間 單位：頭

II期試驗犢牛腹瀉、肺炎均有發(fā)生。兩期試驗犢牛腹瀉情況綜合分析表明，黃芪多糖和銀黃聯(lián)用可有效降低犢牛腹瀉發(fā)生率，降低腹瀉犢牛臨床癥狀的嚴重性，縮短腹瀉持續(xù)時間。將II期試驗犢牛肺炎發(fā)病情況分成1～7 天、8～21 天兩階段統(tǒng)計。1～7天，試驗組和對照組新生犢牛均無肺炎發(fā)生，10 天左右部分犢牛出現(xiàn)癥狀，輕微淚痕，單側(cè)眼睛少量黏稠分泌物，按照美國威斯康辛大學犢牛健康評分表計算總評分小于4 分；部分犢牛癥狀加重表現(xiàn)肺炎，持續(xù)性咳嗽、淚痕、雙側(cè)膿性鼻腔分泌物、單耳或雙耳下垂（中耳炎），采用長效土霉素治療。試驗8～21 天內(nèi)，試驗組犢牛肺炎發(fā)病率顯著低于對照組，死亡率低于對照組但差異不顯著（表1）。犢牛肺炎發(fā)病評分，試驗組1 頭犢牛評分為6 分，對照組7 頭犢牛評分4 分犢牛3 頭、6 分犢牛4 頭。試驗組僅1 頭犢牛發(fā)生肺炎，持續(xù)3 天，最終死亡，而對照組7 頭發(fā)病犢牛中，持續(xù)3、4、5天時間各1 頭，4頭發(fā)病時間≥7 天，最終死亡3 頭。結果表明，黃芪多糖和銀黃聯(lián)用可降低犢牛肺炎發(fā)病率、縮短發(fā)病時間并減輕發(fā)病嚴重程度。

2.2 I期試驗犢牛血清總蛋白、IgG、免疫因子及T細胞淋巴亞群評價

I期試驗40 頭犢牛采血檢測結果顯示，兩組犢牛出生第7天的TP值均高于5.50 g/dL，IgG均高于10.00 mg/mL，并且均在正常范圍內(nèi)，表明試驗組和對照組新生犢牛均未出現(xiàn)被動轉(zhuǎn)運失敗。試驗組犢牛的TP值較對照組高0.28 g/dL，IgG含量較對照組高0.24 mg/mL，均差異顯著（P＜0.05），表明黃芪多糖與銀黃聯(lián)用可在一定程度上促進初乳免疫球蛋白被動轉(zhuǎn)運，提高犢牛免疫力。試驗組犢牛血清IL-2水平較對照組犢牛高3.4 pg/mL，差異不顯著；血清TNF-α水平較對照組低1.34 pg/mL，差異顯著（P＜0.05）。試驗組犢牛CD3、CD4、CD8濃度均高于對照組，差異不顯著；試驗組犢牛CD4/CD8值高于對照組，差異顯著（P＜0.05），表明黃芪多糖和銀黃聯(lián)用可提高新生犢牛的免疫水平。

表4 試驗期間犢牛肺炎發(fā)病情況

3 討論

I期試驗中1～7 日齡犢牛腹瀉發(fā)生率較低、持續(xù)時間較短、糞便評分較輕微，牧場在犢牛出生1 h內(nèi)灌服4 L優(yōu)質(zhì)初乳提供了重要保障。試驗組犢牛TP值及IgG含量均顯著高于對照組，腹瀉發(fā)生率顯著低于對照組，表明黃芪多糖和銀黃聯(lián)用在初乳灌服基礎上可進一步提高初乳中免疫球蛋白的被動轉(zhuǎn)運。7 天后犢牛腹瀉發(fā)生率明顯上升，主要與天氣變化導致的環(huán)境病原微生物富集有關。試驗于2020年9月進行，第10天起經(jīng)歷數(shù)日陰雨天氣，犢牛島積水、圈舍清理不及時、病原微生物富集，導致腹瀉發(fā)生率升高。采集腹瀉犢牛糞便進行輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌K99及隱孢子蟲抗原檢測，結果顯示，輪狀病毒陽性率75.0%、隱孢子蟲陽性率12.5%，且存在合并感染。試驗組新生犢牛8～21 天發(fā)病情況較對照組輕微，表明黃芪多糖和銀黃聯(lián)用能有效抵抗感染性因素以及環(huán)境因素的影響，降低停藥后犢牛發(fā)病率及發(fā)病嚴重程度。輔助性T細胞（Th細胞）是機體免疫系統(tǒng)的重要一環(huán)，主要分泌IL-2、TNF-α等細胞因子。TNF-α升高時，可打破腸道促炎因子與抗炎因子之間的平衡引發(fā)腹瀉。T細胞淋巴亞群分布水平對于抗感染以及免疫調(diào)節(jié)起到重要作用。根據(jù)其表面標志物，T淋巴細胞可分為CD3+T細胞、CD4+T細胞以及CD8+T細胞[5]，CD4/CD8值越高，表明機體免疫功能越強。黃芪多糖和銀黃聯(lián)用能有效調(diào)節(jié)新生犢牛細胞因子和T淋巴細胞亞群分布情況，試驗組TNF-α濃度較對照組降低13.7%，CD4/CD8值提高6.6%，均存在顯著差異，有助于提升新生犢牛免疫力，改善腸道健康，最終降低腹瀉的發(fā)生。

表5 試驗期間肺炎犢牛評分情況 單位：頭

表6 試驗期間肺炎犢牛發(fā)病持續(xù)時間 單位：頭

表7 I期試驗犢牛被動轉(zhuǎn)運、免疫因子及T細胞淋巴亞群情況

II期試驗牧場犢牛腹瀉和肺炎發(fā)病率一直較高，可能與牧場產(chǎn)犢高峰期犢牛小群飼養(yǎng)密度較高（20頭/群）且群內(nèi)日齡相差較大有關。Svensson等[6]發(fā)現(xiàn)，犢牛從犢牛島轉(zhuǎn)至小群飼養(yǎng)后，12～18 頭/圈飼養(yǎng)犢牛較6～9 頭/圈犢牛呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率更高，但在腹瀉方面沒有明顯差異。Costa等[7]發(fā)現(xiàn)，小群飼養(yǎng)過程中日齡差距較大時，日齡偏小犢牛發(fā)病率增加。牧場可以通過增加犢牛島數(shù)量、犢牛圈數(shù)量、調(diào)整分群等方式降低發(fā)病風險。II期試驗結果表明，黃芪多糖和銀黃聯(lián)用可有效減緩犢牛腹瀉發(fā)生率的升高以及臨床癥狀的加重，縮短腹瀉持續(xù)時間。

秋冬季節(jié)由于天氣變化、冷應激等原因，犢牛抵抗力減弱易發(fā)生肺炎。II期試驗8～21 天試驗組犢牛肺炎發(fā)病率顯著低于對照組，降低30.0%。發(fā)病持續(xù)時間方面，試驗組肺炎犢牛為3 天，對照組在3～8 天之間，57.1%的犢牛發(fā)病持續(xù)時間≥1 周。上述結果表明，黃芪多糖和銀黃聯(lián)用可降低肺炎發(fā)病率、縮短發(fā)病時間。黃芪多糖和銀黃聯(lián)用通過降低TNF-α濃度、提高CD4/CD8值等調(diào)節(jié)方式，維持機體促炎與抗炎因子平衡，增強巨噬細胞吞噬作用，促進T淋巴細胞增殖與分化，提升新生犢牛免疫力，減少肺炎發(fā)病[8，9]。死亡犢牛均集中在15～25日齡之間，剖檢顯示肺實變、淤血/出血、部分區(qū)域干酪樣壞死，肺臟病料實驗室檢測確定為支原體感染。黃芪多糖和銀黃可溶性粉聯(lián)用可部分阻斷支原體感染，發(fā)生支原體肺炎時應做到早診斷早治療，出現(xiàn)淚痕的犢牛要引起警惕，評分大于4 分的犢牛及時治療。兩期試驗對照組發(fā)病情況對比發(fā)現(xiàn)，8～21天觀察期內(nèi)，I期試驗對照組犢牛未出現(xiàn)犢牛肺炎，而II期試驗對照組犢牛肺炎發(fā)病率為35.0%，這與飼養(yǎng)模式有關，小群飼養(yǎng)模式犢牛肺炎發(fā)病率要高于犢牛島飼養(yǎng)模式[6]，犢牛島單欄飼養(yǎng)是預防哺乳犢牛肺炎高發(fā)的有效管理手段。

4 結論

口服黃芪多糖和銀黃可溶性粉，可顯著提高新生犢牛血清總蛋白和IgG含量，提升初乳中免疫球蛋白被動轉(zhuǎn)運效率，顯著降低新生犢牛血清TNF-α濃度，顯著提高CD4/CD8值，改善T細胞淋巴亞群分布狀況，從而提升新生犢牛的整體免疫力，顯著降低出生21 天內(nèi)犢牛腹瀉及肺炎的發(fā)病率和死亡率。