郭文軍，韓雨晴，黃鳳輝，徐曉航，解生旭，劉悅，徐雅娟※

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130117；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012；3.葵花藥業(yè)集團(tuán)（吉林）臨江有限公司，吉林白山134600）

哮喘是一種慢性疾病，主要特征是由氣道高反應(yīng)性和炎癥引起的間歇性喘息、咳嗽和呼吸困難[1]。盡管醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)展迅速，但哮喘仍然困擾著許多兒童和成人[2]。糖皮質(zhì)激素類、抗膽堿能藥物是西醫(yī)治療哮喘的首選藥，但只能減輕哮喘發(fā)作癥狀、減少發(fā)作次數(shù)，并且大量使用上述藥物容易導(dǎo)致多種不良反應(yīng)[3,4]。射干麻黃湯出自《金匱要略》卷上，具有溫肺化飲，下氣祛痰之功效[5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明射干麻黃湯可以通過祛痰、抗炎和氣道重塑治療哮喘[6,7]，但中藥具有多組分協(xié)同發(fā)揮作用的特點(diǎn)，基于單一靶點(diǎn)研究作用機(jī)制具有很大局限性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“整體觀”與“辨證論治”的研究思維符合中藥多組分、多靶點(diǎn)及多途徑的治療機(jī)制，其研究方法通過蛋白質(zhì)與化合物相互作用基礎(chǔ)上建立，是開發(fā)中藥活性成分、探索中藥作用機(jī)制的強(qiáng)有力手段[8,9]。本課題組前期完成了射干麻黃湯制劑研究，建立了大鼠哮喘模型進(jìn)行藥效研究，結(jié)果證明射干麻黃湯可減輕支氣管炎癥浸潤(rùn)程度、氣道炎癥反應(yīng)及對(duì)肺臟病理?yè)p傷而達(dá)到治療哮喘作用，但基于大鼠等動(dòng)物模型的射干麻黃湯的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析未見報(bào)道[10,11]，本文選擇物種為“大鼠”通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)分析探討射干麻黃湯治療哮喘的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，并進(jìn)行分子模擬輔助驗(yàn)證，為后續(xù)開展射干麻黃湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 射干麻黃湯有效成分篩選

中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP：https://tcmspw.com/tcmsp.php/）是一個(gè)獨(dú)特的中藥系統(tǒng)藥理平臺(tái)，可捕獲藥物、靶點(diǎn)和疾病之間的關(guān)系[12]，利用TCMSP檢索射干麻黃湯中半夏、大棗、款冬花、麻黃、射干、生姜、五味子、細(xì)辛和紫菀含有的化合物，并設(shè)置化合物的口服利用度（OB≥40%）、類藥性（DL≥0.2）和半衰期（HL≥4）篩選射干麻黃湯有效成分。

1.2 有效成分作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisst argetprediction.ch/）是一個(gè)根據(jù)有效成分與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知活性物質(zhì)2D和3D結(jié)構(gòu)的相似度來預(yù)測(cè)有效成分作用靶點(diǎn)的web服務(wù)器。利用TCMSP和pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取射干麻黃湯有效成分的mol2格式的結(jié)構(gòu)文件或Canonical SMILES結(jié)構(gòu)式，導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“大鼠”來獲取有效成分作用靶點(diǎn)，Probability*值大于0的靶點(diǎn)即為有效成分的作用靶點(diǎn)。

1.3 有效成分―靶點(diǎn)―哮喘（C-T-D）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵活性成分獲取

以“asthma”為關(guān)鍵詞在Gene cards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）中獲取哮喘的治療靶點(diǎn)，其中Relevance score≥2倍中位數(shù)的靶點(diǎn)被視為治療哮喘的靶點(diǎn)。利用Venn分析將哮喘的治療靶點(diǎn)和有效成分作用靶點(diǎn)取交集得射干麻黃湯對(duì)哮喘的治療靶點(diǎn)，將具有活性成分、哮喘以及治療靶點(diǎn)信息的數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行C-T-D網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建和可視化，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度的大小對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，并根?jù)“節(jié)點(diǎn)度＞中位數(shù)”篩選出射干麻黃湯關(guān)鍵活性成分。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取

PPI網(wǎng)絡(luò)作為一種新的藥物研究方法，可用于闡明預(yù)測(cè)目標(biāo)與其他蛋白之間的關(guān)系。String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org）是用于搜索蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，它提供有關(guān)蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)和相互作用的信息。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建射干麻黃湯治療哮喘靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，隨后將關(guān)鍵活性成分映射在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中構(gòu)建關(guān)鍵活性成分―PPI網(wǎng)絡(luò)圖，圖中靶點(diǎn)連接度越大，與它連接的蛋白或活性成分就越多，它在哮喘發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮的作用就越重要，據(jù)此篩選關(guān)鍵活性成分作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 功能富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov）是對(duì)基因提供一套全面功能注釋，以了解大量基因背后的生物學(xué)含義的工具。將PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“大鼠”，以P＜0.05為條件進(jìn)行KEGG Pathway、生物學(xué)過程（biological process,BP）、細(xì)胞組成（cell composition,CC）、分子功能（molecular function,MF）富集。

1.6 分子對(duì)接

從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org）下載目標(biāo)靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)，并使用PyMOL軟件去除靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的結(jié)晶水和其他小分子，并將其保存為pdb格式，然后將結(jié)構(gòu)文件放入AutoDockTool 1.5.6程序中，添加原子電荷，并在添加氫原子后將其保存為pdbqt格式。將射干麻黃湯關(guān)鍵活性成分的mol2格式的結(jié)構(gòu)文件放入AutoDockTool程序，添加原子電荷并將其保存為pdbqt格式作為對(duì)接配體。使用Autodockvina軟件模擬分子對(duì)接，以確定目標(biāo)蛋白與潛在生物活性成分的結(jié)合親和力。這些生物活性成分與靶蛋白之間的結(jié)合親和力被用作評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合親和力越小，結(jié)合能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 射干麻黃湯活性成分及其作用靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索了射干麻黃湯中各味中藥的化學(xué)成分，并通過OB、DL和HL 3個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)篩選出了射干麻黃湯的93個(gè)有效成分，其中麻黃、射干、款冬花和大棗為射干麻黃湯貢獻(xiàn)了多數(shù)活性成分。將射干麻黃湯的93個(gè)有效成分依次導(dǎo)入SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得84個(gè)有效成分的3 263個(gè)靶點(diǎn)，去重復(fù)后得到465個(gè)有效成分作用靶點(diǎn)。

2.2 C-T-D網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵活性成分

在Gene cards數(shù)據(jù)庫(kù)中1 475個(gè)靶點(diǎn)被篩選為哮喘的治療靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)與有效成分作用靶點(diǎn)取交集得有效成分治療哮喘的靶點(diǎn)。將有效成分、有效成分治療哮喘的靶點(diǎn)和哮喘導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建了C-T-D網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化（圖1），該網(wǎng)絡(luò)圖是由169個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 009條邊構(gòu)成，其中包含哮喘、99個(gè)有效成分治療哮喘的靶點(diǎn)和69個(gè)有效成分，將有效成分節(jié)點(diǎn)的大小按照其連接度大小繪制，并篩選出消旋卡文定堿、黃芩素及白藜蘆醇等22個(gè)治療哮喘的關(guān)鍵活性成分，詳細(xì)信息見表1。

圖1 活性成分-靶點(diǎn)-哮喘（C-T-D）網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 The active ingredient-target-asthma(C-T-D)network diagram

表1 射干麻黃湯治療哮喘關(guān)鍵活性成分Table 1 Active ingredients for various medicinal materials of Shegan Mahuang Decoction

續(xù)表

2.3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)

利用String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建射干麻黃湯治療哮喘靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，隨后將關(guān)鍵活性成分映射在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中構(gòu)建“關(guān)鍵活性成分-PPI網(wǎng)絡(luò)圖”（圖2），根據(jù)靶點(diǎn)連接度的大小篩選出前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin H Synthase-2,Ptgs2）、過氧化物酶體增生激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,Pparg）、腺苷A1受體（adenosine A1 receptorAdora1）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（protein kinase B,Akt1）等15個(gè)射干麻黃湯治療哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 射干麻黃湯治療哮喘的關(guān)鍵活性成分-PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The key active ingredients of Shegan Mahuang Decoction in the treatment of the asthma-PPI network diagram

2.4 功能富集和作用通路富集

將PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的射干麻黃湯治療哮喘的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“大鼠”，以P＜0.05為條件，進(jìn)行KEGGPathway、BP、CC和MF分析。如圖3 A所示，這些靶點(diǎn)主要參與胞質(zhì)鈣離子濃度的正調(diào)節(jié)、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)和腺苷酸環(huán)化酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程；細(xì)胞組成為質(zhì)膜、軸突末端和神經(jīng)元胞體等；主要發(fā)揮G蛋白偶聯(lián)腺苷受體活性、腎上腺素結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、磷脂酰肌醇磷脂酶C活性、多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)受體活性和花生四烯酸15-脂肪氧化酶活性等細(xì)胞功能。如圖2所示，這些靶點(diǎn)主要參與鈣信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）信號(hào)通路、色氨酸（tryptophan,TRP）通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）-蛋白激酶G（protein kinase G,PKG）信號(hào)通路、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信號(hào)通路和磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）信號(hào)通路等。推測(cè)射干麻黃湯中消旋卡文定堿、黃芩素和白藜蘆醇等22個(gè)治療哮喘的關(guān)鍵活性成分通過Ptgs2、Adora1、Pparg和Akt1等15個(gè)靶點(diǎn)參與上述信號(hào)通路中發(fā)揮治療哮喘的作用。

圖3 射干麻黃湯作用靶點(diǎn)的：生物學(xué)過程、細(xì)胞組成、分子功能富集（A）；KEGG Pathway富集分析（B）Fig.3 The target of Shegan Mahuang Decoction:biological process,cell composition,molecular function enrichment(A);KEGG Pathway enrichment analysis(B)

2.5 分子對(duì)接

選取射干麻黃湯治療哮喘的關(guān)鍵活性成分-PPI網(wǎng)絡(luò)圖中連接度前四名的靶點(diǎn)進(jìn)行分子模擬，如表1所示，首先分別選取靶點(diǎn)的陽性藥進(jìn)行分子對(duì)接，獲取各自陽性藥與靶點(diǎn)的親和能力，隨后將射干麻黃湯中22個(gè)關(guān)鍵活性成分的mol2格式的結(jié)構(gòu)文件放入到Auto-DockTool程序中進(jìn)行分子模擬，結(jié)果顯示關(guān)鍵成分均能與轉(zhuǎn)位因子蛋白（translocator protein,Tspo）、Ptgs2、Pparg和Adora1進(jìn)行結(jié)合，其中消旋卡文定堿與Adoral、Ptgs2和Tspo靶點(diǎn)的結(jié)合能力大于陽性藥，anhydrobelachinal和epianhydrobelachinal與Ppary的結(jié)合能力最強(qiáng)，其中消旋卡文定堿展現(xiàn)出極強(qiáng)的結(jié)合能力，提示該化合物在治療哮喘中發(fā)揮重要作用。

表2 射干麻黃湯關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵蛋白進(jìn)行結(jié)合能力Table 2 The binding ability of key active ingredients of Shegan Mahuang Decoction and key proteins

3 討論

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索了射干麻黃湯中各味中藥的化學(xué)成分，并通過藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)篩選出93個(gè)有效成分，通過構(gòu)建C-T-D網(wǎng)絡(luò)圖篩選出消旋卡文定堿、黃芩素和白藜蘆醇等22個(gè)治療哮喘的關(guān)鍵活性成分。已證明消旋卡文定堿可抑制促炎細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子-（tumor necrosis factor-,TNF-）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6,IL-6）的產(chǎn)生以及NF-B信號(hào)通路的激活，進(jìn)而預(yù)防和治療肺部炎癥疾病[13]。黃芩素可通過調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞1（Th1）/輔助性T細(xì)胞2（Th2）細(xì)胞因子失衡和肥大細(xì)胞釋放組胺來治療過敏性哮喘[14]。白藜蘆醇可減輕哮喘導(dǎo)致的氣道炎癥和氣道重塑[15]，可調(diào)控過敏性哮喘小鼠熱休克因子1（heatshockfactor1，HSF1）與腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）的表達(dá)，進(jìn)而降低哮喘引發(fā)的炎性反應(yīng)及氣道高阻力，減輕肺組織損傷[16,17]，白藜蘆醇能夠減少哮喘發(fā)作產(chǎn)生的氣道黏液，減輕發(fā)作癥狀[18]。

通過網(wǎng)絡(luò)分析和分子對(duì)接研究表明，射干麻黃湯的藥效物質(zhì)中的22個(gè)關(guān)鍵活性成分是通過Ptgs2、Adora1、Pparg和Akt1等靶點(diǎn)發(fā)揮治療哮喘的作用。在哮喘氣道中，Adora1等受體與腺苷相互作用發(fā)揮抗炎作用[19]。在哮喘患者中，Pparg基因表達(dá)與氣道炎癥和重塑反應(yīng)有關(guān)，激活Pparg可下調(diào)Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生和嗜酸性粒細(xì)胞功能，減少過敏性哮喘中的肺部炎癥和-干擾素（interferon-,IFN-）、IL-4和IL-2的產(chǎn)生[20]。Akt1是PI3K-Akt信號(hào)通路中的重要分子，PI3K-Akt信號(hào)通路是介導(dǎo)肥大細(xì)胞炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子分泌的主要通路，在哮喘炎癥的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[21]。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子模擬初步確定了射干麻黃湯中22個(gè)關(guān)鍵活性成分主要作用于15個(gè)靶點(diǎn)通過多條途徑治療哮喘，揭示了射干麻黃湯通過“多成分、多靶點(diǎn)和多途徑”治療哮喘的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為射干麻黃湯的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。