吳新新， 韓明月， 余道軍

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain raction，PCR）通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入正反向引物、DNA聚合酶、dNTP實現(xiàn)特定基因的體外復(fù)制，充分利用了堿基互補配對、雙鏈性質(zhì)、DNA分子熔解溫度的優(yōu)勢[1]，因其特異性強、靈敏度高、簡便、快速、純度要求低等優(yōu)點，成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)檢驗常用的技術(shù)之一。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更加特異、靈敏和準確的核糖核酸酶H依賴性聚合酶鏈反應(yīng)（ribonuclease H-dependent polymerase chain reaction，rhPCR）技術(shù)被DOBOSY等[2]開發(fā)出來。rhPCR在傳統(tǒng)PCR原理的基礎(chǔ)上，使用了一種封閉式可切割的rhPCR引物。rhPCR引物在反應(yīng)初始不具備延伸的能力，只有在與目標DNA堿基序列互補時才能被核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）H消化，從而獲得延伸的能力，啟動擴增反應(yīng)[3]。rhPCR能夠有效解決PCR中引物二聚體形成和脫靶擴增的問題[4]，提高反應(yīng)的特異性。rhPCR在擁有高度特異性的同時，靈敏度和準確性相對于傳統(tǒng)PCR都有明顯提高[5]，在單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）[6]、多重靶分子、具有密切相關(guān)序列的靶標及低水平靶分子檢測等方面具有較大優(yōu)勢。本文對rhPCR的體系組成、關(guān)鍵酶、rhPCR引物設(shè)計方法、具體應(yīng)用和發(fā)展前景作一綜述。

1 rhPCR的關(guān)鍵技術(shù)

rhPCR在常規(guī)PCR擴增體系的基礎(chǔ)上增加了RNase H2酶、正反rhPCR引物。具體的擴增體系包括10×擴增緩沖液、Mg2+、甜菜堿、RNase H2、4種dNTP混合物、正反rhPCR引物、Taq DNA聚合酶、DNA模板。

1.1 RNase H2

RNase H普遍存在于各種生物中，主要分為2個家族，目前根據(jù)其氨基酸序列的不同分為RNase H1型和RNase H2型。RNase H1包括細菌RNase HⅠ、哺乳動物RNase HⅡ、逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H域和古細菌RNase HⅠ，RNase H2包括細菌RNase HⅡ、細菌RNase HⅢ、哺乳動物RNase HⅠ和古細菌RNase HⅡ[7]。RNase H1的反應(yīng)底物至少需要3個連續(xù)的RNA殘基，其中對4個連續(xù)RNA殘基的底物才具有較高的催化活性，不能切割單個RNA殘基，使其應(yīng)用受限。

rhPCR通常使用來自深淵熱球菌的RNase H2[8]，這是一種核糖核酸內(nèi)切酶，具有從基因組DNA中去除單個核糖核苷酸的獨特作用[9]。rhPCR利用了RNase H2的特殊性質(zhì)，即可以特異性地水解DNA-RNA雜合鏈中的RNA，但不能水解單鏈或雙鏈DNA或RNA中的磷酸二酯鍵，不能消化單鏈或雙鏈DNA或RNA[10]。因此只有當(dāng)互補靶DNA堿基存在時，RNase H2才能消化DNA-RNA雜交鏈，使DNA-RNA雜交鏈在RNA堿基的5′-側(cè)發(fā)生裂解，留下具有3′-羥基的DNA寡核苷酸，該3′-羥基DNA寡核苷酸能夠起到引物的作用，從而允許引物延伸[11]。由于僅在與互補靶序列緊密結(jié)合時才發(fā)生rhPCR引物的裂解切割，故極大地提高了反應(yīng)的準確性。事實上，RNase H2是唯一能夠通過水解核糖核酸5′-端的磷酸二酯鍵來啟動無突變?nèi)コ颂呛塑账徇^程的酶[12]。

RNase H2具有熱穩(wěn)定性和溫度依賴性，在70、60、50、30 ℃條件下的活性分別為70%、64%、23%、＜1%，且在95 ℃ 90 min條件下仍能保持2/3的活性[2]，這表明RNase H2足以在所有PCR預(yù)期的使用溫度范圍內(nèi)保持活性。因此，在帶有封閉式引物的rhPCR體系中，RNaseH2能夠與任何熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行常規(guī)的熱啟動反應(yīng)，極大降低了非特異性擴增和引物二聚體的形成，顯著提高了檢測特異性。RNase H2可能對錯配的核糖核苷酸有輕微的切割活性，在rhPCR反應(yīng)過程中應(yīng)避免過量使用，否則將會導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性擴增條帶。RNase H2雖然能夠識別具有不匹配的堿基對的底物，但發(fā)生在RNA-DNA堿基對（“0”位置）或其附近（“-3”、“-2”、“-1”和“+1”位置）的錯配會顯著降低RNase H2的切割效率（將RNA所在的核苷酸位置標為“0”位置，往5′-端的核苷酸依次標為“-1”、“-2”、“-3”；往3′-端的核苷酸依次標為“+1”、“+2”、“+3”），特別是當(dāng)錯配發(fā)生在RNA-DNA堿基對時，這一特性將會最大限度地降低同源序列的錯誤擴增，提高檢測特異性。

1.2 rhPCR引物的設(shè)計與合成

常規(guī)PCR引物普遍存在自我擴增現(xiàn)象，這會導(dǎo)致PCR檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性，或者由于自我擴增消耗引物及體系成分導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。雖然可以通過引物篩選設(shè)計、優(yōu)化反應(yīng)條件、應(yīng)用熱啟動酶[13]、酶制劑AmpliTaq Gold或采用降落PCR技術(shù)[14]來減少引物二聚體[15]的產(chǎn)生，但一定程度上增加了檢測成本和操作的復(fù)雜性。

rhPCR引物是在高度保守的目標寡核苷酸序列區(qū)域內(nèi)插入1段RNA堿基序列，形成DNARNA-DNA的堿基序列，并且該引物的3′-末端被化學(xué)基團封阻，導(dǎo)致引物無法延伸。目前rhPCR引物設(shè)計以商用軟件設(shè)計為主，最常使用的是PrimerQuest設(shè)計工具（美國Integrated DNA Technologies公司）[16]。在常用的引物序列之后（3′-末端）按照“rDDDDx”的模式加上后續(xù)堿基與修飾，合成相應(yīng)的阻斷式可切割的rhPCR引物，其中“r”是與目標DNA序列匹配的RNA堿基，“D”是與目標序列匹配的DNA堿基，“x”是C3丙二醇間隔區(qū)或終止雙脫氧胞嘧啶ddC；或者以“rDxxDM”的模式添加末端堿基，其中“r”是與目標DNA序列匹配的RNA堿基，“D”是與目標序列匹配的DNA堿基，“xx”是2個C3間隔區(qū)，“M”是1個與目標序列錯配的DNA堿基。要使RNase H2實現(xiàn)最佳切割，DNA 雙鏈5′-端到RNA殘基至少需要8～10個堿基對，DNA雙鏈3′-端到RNA堿基則需要4～5個堿基對[17]。在rhPCR中，為確保RNA殘基的5′-端裂解產(chǎn)物是功能性引物，5′-裂解端必須始終存在10個以上的DNA堿基。值得注意的是，rhPCR引物中RNA鍵的非特異性水解不能導(dǎo)致引物活化，只有通過RNase H2的裂解，rhPCR引物才能有活性，進行引物的延伸。即使二價陽離子（如Mg2+）或高溫條件可以促進含有RNA的寡核苷酸非特異性水解，但在PCR的熱循環(huán)條件下，引物的非特異性水解可以忽略不計。假如樣本受到嚴重污染，則反應(yīng)混合物中可以加入抑制劑，如人胎盤RNase抑制劑。一方面封閉式可切割rhPCR引物的使用，使得引物在未被RNase H2識別和切割前不具有活性，避免引物的自我擴增；另一方面rhPCR引物的切割僅在其與互補的靶序列緊密結(jié)合時發(fā)生，可提高反應(yīng)的特異性。

1.3 DNA聚合酶

目前最常用于PCR的熱穩(wěn)定DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶是從水生嗜熱桿菌中提取的耐熱DNA聚合酶，是第1個應(yīng)用于PCR的極端耐熱的DNA聚合酶，相對分子質(zhì)量為94 000，含832個氨基酸，全長2 496 bp，在92.0、95.0、97.5 ℃時的半衰期分別為130、40、5～6 min。Taq DNA聚合酶具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′核酸外切酶活性，無3′→5′外切酶活性，缺乏對單核苷酸配對錯誤時的校正能力，在PCR過程中錯配率達到10-4[18]，且擴增效率會隨著擴增子大小增加到1 kb以上而降低[19]。Taq DNA聚合酶活性易被環(huán)境和血液樣本抑制，但該酶的適用溫度滿足rhPCR反應(yīng)溫度的全過程，只需在反應(yīng)起始添加1次酶即可，簡化了操作流程，可避免在反復(fù)添加酶的過程中造成污染。

隨后學(xué)者們又逐步發(fā)現(xiàn)了有校正功能的耐熱DNA聚合酶，包括Vent、Deep、 Pfu、Tgo、KOD1、Tga[20]等DNA聚合酶，這些酶都具有5′→3′核酸外切酶（校對）活性，能夠糾正聚合反應(yīng)過程中的錯誤配對，顯著降低PCR過程中的錯配率[21]，具有極高的保真性。雖然目前缺乏這些酶在rhPCR中的應(yīng)用研究，但不可否認其具有一定的研究價值。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄酶

在某些情況下，RNase H2依賴性PCR可以與逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合起來，用于RNA的檢測[22]。這時候反應(yīng)中就需要使用逆轉(zhuǎn)錄酶，先將RNA模板轉(zhuǎn)換為cDNA再進行DNA擴增反應(yīng)。目前常用的熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶是AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶[23]，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶在高溫環(huán)境下保真性高于MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶[24]，更適合rhPCR。AMV逆轉(zhuǎn)錄酶分離自重組禽類成髓細胞瘤，是由2個不同的亞基（α和β亞基）組成的異源二聚體[25]，具有多種活性，包括RNA和DNA依賴的DNA聚合酶活性、DNA-RNA解旋活性、序列特異的Mn2+依賴性核酸內(nèi)切酶活性[26]，因此可逆轉(zhuǎn)錄含有大量二級結(jié)構(gòu)的RNA靶序列。

1.5 Mg2+

Taq DNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，對Mg2+濃度非常敏感。在反應(yīng)過程中，Mg2+與dNTP及模板結(jié)合，降低了酶的活化能，從而促進酶的催化作用。由于模板雜交體的解鏈和退火溫度受二價陽離子的影響，所以Mg2+濃度對反應(yīng)的成功與否起重要作用[27]。RNase H2也是Mg2+依賴性酶，只有在有Mg2+的環(huán)境中才能發(fā)揮裂解作用[28]，同時Mg2+可以克服雜交結(jié)合結(jié)構(gòu)域與核酸之間的非特異性相互作用[7]，可獲得最佳的RNase H活性。Mg2+濃度對rhPCR同樣非常重要，較高的游離Mg2+濃度可以增加rhPCR擴增產(chǎn)物量，但也會增加非特異性擴增，降低反應(yīng)特異性，Mg2+濃度過低則會影響擴增效率，甚至導(dǎo)致擴增失敗。總的來說，Mg2+濃度應(yīng)高于dNTP濃度，常用濃度為1.5 mmol/L，但RNase H2在Mg2+濃度低至1 mmol/L時仍保持較高的活性。因此，普通PCR體系中應(yīng)用的Mg2+濃度都適用于rhPCR體系。在多數(shù)情況下，為了確定rhPCR體系中的最佳Mg2+濃度，可以用遞增Mg2+濃度的方法進行預(yù)實驗，選出rhPCR體系最合適的Mg2+濃度，確保rhPCR擴增效率。

2 rhPCR的優(yōu)點

與常規(guī)PCR相比，rhPCR利用RNaseH2在rhPCR引物與目標位點結(jié)合后激活rhPCR引物的特性，消除引物二聚體的形成，減少非特異性擴增[5]，且能提高檢測靈敏度，在低豐度DNA及RNA的研究上具有較大優(yōu)勢。采用非熱啟動的DNA聚合酶能夠降低rhPCR成本，同時rhPCR沒有改變PCR的工作原理，可在rhPCR的基礎(chǔ)上建立RNase H依賴性的實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（ribonuclease H-dependent quantitative realtime polymerase chain reaction，rh-qPCR）檢測體系。rh-qPCR在同屬物種亞型分析方面優(yōu)勢明顯：一些同屬物種核苷酸序列差異性非常小，難以設(shè)計特異性的常規(guī)熒光定量PCR方法，采用rh-qPCR方法就能夠很好地解決這個問題。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[29]目前應(yīng)用較廣，不需要模板的熱變性及重復(fù)溫度循環(huán)，也不需要特殊的儀器，操作簡單，靈敏度較高。近來也有學(xué)者探尋其用于SNP基因分型的可能性[30]。但是，LAMP的假陽性問題嚴重，且容易形成氣溶膠污染[31]，或者出現(xiàn)非特異性擴增的情況[32]。rhPCR的高特異性能夠有效地避免LAMP的假陽性，其極高的檢測靈敏度使得在低濃度的模板DNA反應(yīng)中也能有很好的表現(xiàn)，且rhPCR同樣具有操作簡便、耗時短的特點。因此，LAMP難以滿足多重PCR的技術(shù)要求，而rhPCR有望成為多重靶標核酸檢測的主要方法。BELTZ等[33]報道了1次rhPCR同時檢測2個SNP。與DNA測序法[34]相比，rhPCR靈敏度較高，與其他核酸分子檢測技術(shù)相比，rhPCR具有一定的優(yōu)勢。

3 rhPCR的應(yīng)用

由于rhPCR的反應(yīng)特異性、靈敏度、保真度均優(yōu)于傳統(tǒng)PCR，且同時能夠滿足多重PCR技術(shù)的要求，降低了檢測成本，縮短了檢測時間。因此，rhPCR的應(yīng)用范圍越來越廣，包括SNP檢測、環(huán)境核酸的定性定量分析、牛乳miRNA人體生物利用研究、細菌基因分型等，涉及不同領(lǐng)域。

3.1 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

DOBOSY等[2]開發(fā)rhPCR的初衷是為了檢測與腫瘤密切相關(guān)的Smad7基因的SNP，提高其特異性。研究表明rhPCR能夠通過消除引物二聚體的形成提高反應(yīng)特異性，同時在同源序列的錯誤擴增方面，rhPCR的特異性遠高于使用未修飾引物的傳統(tǒng)PCR，同時還顯示出比標準等位基因特異性PCR更大的區(qū)分度。BELTZ等[33]基于rhPCR原理研發(fā)了rhAmp SNP基因分型法并用于人類SNP基因分型的研究，證明rhPCR技術(shù)在SNP檢測上具有突出的優(yōu)勢，基于rhPCR的多重SNP基因分型或?qū)⒊蔀榭赡?。WANG等[35]的研究結(jié)果顯示，rhPCR可在人血漿中檢測出牛miRNA，表現(xiàn)出極高的檢測特異性（可區(qū)分核苷酸序列相差僅1個核苷酸的內(nèi)源性和外源性miRNA）。LABBé等[16]證實，使用rhPCR鑒定海德堡沙門氏菌的基因分型比傳統(tǒng)的脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）和噬菌體分型具有更高的分辨率，其檢測結(jié)果與全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）完全相關(guān)，可作為WGS的一種快速、低成本的替代方案。LI等[36]運用rhPCR對T細胞受體進行測序，用以確定單細胞中配對的α/β T細胞受體（T cell receptor，TCR）克隆型，相對于其他TCR的測序方法，rhPCR操作流程大大簡化，縮短了時間，也提高了測序的成功率。隨著rhPCR技術(shù)的不斷成熟和改進，其臨床應(yīng)用將會越來越廣泛，有望成為基因診斷和臨床個體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。

3.2 非醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

rhPCR在非醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上的應(yīng)用也越來越多。CAHOON等[37]證實rhPCR技術(shù)適用于藻類的SNP檢測。ZUZAK等[38]使用rhPCR區(qū)分加拿大阿爾伯塔省常見蘆葦?shù)谋镜貋喎N和入侵亞種，該方法與廣泛使用的限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）方法一樣精確，但更省時、簡便且成本低。MCALLISTER等[39]在原有基礎(chǔ)上開發(fā)出依賴RNase H2的rh-qPCR方法：采用rhPCR結(jié)合SYBR Green的方法繪制出標準曲線，用于量化山松甲蟲真菌共生菌；該方法顯示出比常規(guī)PCR更高的特異性和靈敏度，表明rh-qPCR適用于復(fù)雜環(huán)境樣本的檢測。RODGERS等[40]將rhPCR技術(shù)用于水生環(huán)境DNA（environmental deoxyribonucleic acid，eDNA）的研究中，解決了某些情況下因密切相關(guān)的同屬物種缺乏線粒體序列多態(tài)性而無法使用常規(guī)特異性熒光定量PCR的問題，并且rhPCR的高靈敏度使其在低濃度樣本的檢測中具有明顯優(yōu)勢；另外，他們還解決了復(fù)雜環(huán)境樣本對RNase H2的抑制問題。高特異性和高靈敏度的rhPCR在密切相關(guān)物種鑒別和低濃度樣本上具有獨特優(yōu)勢，未來必然會有更多領(lǐng)域運用該技術(shù)。

4 rhPCR技術(shù)的展望

rhPCR技術(shù)通過RNase H2可選擇性裂解RNA-DNA雜合鏈的特性以及特殊設(shè)計的封閉式可切割rhPCR引物實現(xiàn)了目標DNA擴增的高特異性、高靈敏度、高重復(fù)性，成為一種操作簡便、耗時短、效率高的核酸檢測技術(shù)。目前，國外學(xué)者已將rhPCR應(yīng)用于SNP檢測、環(huán)境核酸定量分析、細菌等位基因分型等多個領(lǐng)域，并取得一定的成果，但國內(nèi)尚缺乏對這項技術(shù)的研究與應(yīng)用。此外，rhPCR在多重PCR方面展示出其應(yīng)用優(yōu)勢，能夠解決多重PCR引物二聚體及非特異性擴增等諸多問題。在等位基因檢測中，rhPCR對于密切相關(guān)的同屬物種具有很好的適應(yīng)性，而且與RFLP具有相同的精確性，耗時更少，成本更低。當(dāng)檢測多個樣本時，rhPCR的檢測效率會非常突出。由此可見，rhPCR技術(shù)在病原體及微生物基因型的快速檢測與鑒別、遺傳疾病診斷以及基因缺失、突變和多態(tài)性分析等領(lǐng)域具有不可限量的發(fā)展前景。rhPCR的技術(shù)難點在于rhPCR引物的設(shè)計，如果能夠研究出快速自動設(shè)計rhPCR引物的軟件，簡化操作，提高效率，將會有更多領(lǐng)域采用該技術(shù)，在很大程度上能夠推動rhPCR的大范圍應(yīng)用與技術(shù)發(fā)展。