周新成，陳新，盧誠，廖明馨，王海燕，唐清杰，任軍方，王文泉

摘? 要：木薯是重要的糧食作物，但塊根中含有的氰苷及其產(chǎn)生的氫氰酸嚴(yán)重影響木薯的食用品質(zhì)，增加加工成本。α-醇腈裂解酶（alpha-hydroxy nitrile lyase， HNL）是植物催化醇腈裂解產(chǎn)生氫氰酸的關(guān)鍵酶。重測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，‘華南8號(hào)木薯品種中HNL編碼基因家族的一個(gè)成員12G132600在編碼區(qū)內(nèi)部發(fā)生了終止突變，導(dǎo)致基因編碼區(qū)變短。本研究對(duì)國內(nèi)外251份木薯種質(zhì)資源的重測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)60份材料醇腈裂解酶基因12G132600存在相同的終止突變，該60份材料全部是終止突變與非終止突變的雜合基因型，且全部為栽培類型木薯。說明該突變是木薯由野生型馴化為栽培型以后發(fā)生的。通過對(duì)木薯品種‘華南9號(hào)該基因的克隆測(cè)序以及與已發(fā)表的木薯品種‘TME3基因組序列的比對(duì)分析，證實(shí)了該突變?cè)谀臼砥贩N中真實(shí)存在。

關(guān)鍵詞：木薯;氫氰酸;醇腈裂解酶;種質(zhì)資源;基因突變

中圖分類號(hào)：S533? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Premature Mutation Frequencies in Coding Region of Gene 12G132600 Encoding Alpha-hydroxy Nitrile Lyase in Cassava Germplasms

ZHOU Xincheng1，2， CHEN Xin1，2， LU Cheng1，2， LIAO Mingxin1，2， WANG Haiyan1，2， TANG Qingjie3，

REN Junfang4，5*， WANG Wenquan1，2*

1. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences. Haikou， Haina 571101， China; 2. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs. Haikou， Hainan 571101， China; 3. Alimentarn Crop Institute， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571100， China; 4. Tropical Horticulture Research Institute， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571100， China; 5. Hainan Key Laboratory for innovative Development and Utilization of Tropical Special Economic Plants. Haikou， Hainan 571100， China.

Abstract： Cassava is an important food crop in the world. The presence of high-level cyanogenic glucosides and HCN produced poses a major nutritive drawback and means a higher labor costs to remove these toxic substances. Cyanogensis is an important protective mechanism for plant to avoid grazing by animals. Alpha-hydroxy nitrile lyase （HNL） plays a key role in cyanogensis reaction. We found that there was a premature termination mutation in the coding sequence of HNL gene of cassava variety SC8， which would result in short length in protein encoded and could affect the function of the protein. These researches would give useful information about the role of the point mutation and provide new ideals for selecting cassava accessions with low-content hydrocyanic acid in molecular breeding. Firstly we surveyed the resequencing data of 251 cassava varieties from all around the world to characterize the same mutation site in HNL gene and found that there were sixty accessions belonging to cultivated cassava harboring the same mutation as SC8， indicting the premature mutation occurred during or after cassava domestication. We cloned and sequenced the orthologous genes of 12G132600 in SC9 by PCR and compared the corresponding sequence of TME3 from the genome assembly. The results further strengthened the evidence of this premature mutation in cassava varieties.

Keywords： cassava; hydrocyanic acid; alpha-hydroxy nitrile lyase; germplasms; gene mutation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.004

木薯（Manihot esculenta Crantz）是世界三大薯類作物之一，可作為糧食供人類食用。世界上將木薯作為主糧的人群超過7億人，主要分布在非洲和中南美洲國家，例如尼日利亞，年產(chǎn)鮮薯4000萬噸，其中90%以上充當(dāng)糧食。目前在我國，鮮薯主要作為加工淀粉和酒精的原料，較少直接食用。但隨著我國耕地逐年減少、人口越來越多，糧食安全問題日益突出。而木薯具有抗旱、耐瘠薄等特點(diǎn)，在較少水肥條件下也可獲得比較高的收成，因此，選育食用木薯品種、發(fā)展食用木薯生產(chǎn)，可在一定程度上緩解我國的糧食緊張問題。

木薯作為食物的一個(gè)主要限制因子是其塊根的氰苷含量較高。氰苷，又名生氰葡萄糖苷，是一種廣泛存在于高等植物中的糖苷類次生代謝產(chǎn)物，在植物受到蟲害、動(dòng)物啃食等損傷的情況下，會(huì)轉(zhuǎn)化為醇腈，醇腈在α-醇腈裂解酶（又名醇腈酶）催化下裂解產(chǎn)生氫氰酸，對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒害，從而對(duì)植物起保護(hù)作用[1-2]，這個(gè)過程被稱為生氰反應(yīng)（cyanogenesis）。目前已在超過2500多種植物中檢測(cè)到含有氰苷類物質(zhì)，包括常見的高粱、豆類、苦杏仁等等，木薯也以含氰苷聞名[3-4]。含氰苷可使植物抗逆性增強(qiáng)，對(duì)自身是有益的，但高氰苷含量的木薯，不僅食用時(shí)有苦味，而且會(huì)使人中毒。因此，了解木薯氰苷代謝規(guī)律，選育低氰苷含量或者很少產(chǎn)生有毒氫氰酸的木薯品種，是發(fā)展食用木薯的重要課題。

在植物體內(nèi)，人們對(duì)生氰反應(yīng)的基本過程已經(jīng)明確，首先是由少數(shù)幾種氨基酸經(jīng)過氧化反應(yīng)生成醇腈，醇腈不穩(wěn)定，需要在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定性好的氰苷。例如，在高粱中，L-酪氨酸在2種細(xì)胞色素P450氧化酶CYP79A1和CYP71E1的作用下首先生成不穩(wěn)定的醇扁桃腈[5-6]，最后在糖基轉(zhuǎn)移酶UGT85B1的作用下生成穩(wěn)定的蜀黍氰苷（dhurrin）[7]。在動(dòng)物啃食過程中，不穩(wěn)定的醇扁桃腈在pH>6時(shí)會(huì)自發(fā)產(chǎn)生氫氰酸，在pH<6時(shí)，需要α-醇腈裂解酶催化才可產(chǎn)生氫氰酸，木薯中情況也是如此[8]。由于植物代謝經(jīng)常產(chǎn)生有機(jī)無機(jī)的酸類物質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)pH通常小于6，所以α-醇腈裂解酶是植物生氰反應(yīng)的關(guān)鍵酶[8]。人們從植物中早已提取到α-醇腈裂解酶的純化物，并獲得該酶的X-射線晶體結(jié)構(gòu)圖。該酶分子由大約260個(gè)氨基酸組成，其中121～165位的肽段為底物識(shí)別和結(jié)合區(qū)域。而保守的位于第80位的絲氨酸、第208位的天冬氨酸和第236位的組氨酸是催化活性中心位點(diǎn)。這些酶活性結(jié)構(gòu)的知識(shí)為利用該酶將氫氰酸人工合成生產(chǎn)醇腈類化合物奠定了重要基礎(chǔ)，也使該酶成為基因工程中重要的工程酶。人們已經(jīng)從木薯中分離到多個(gè)編碼α-醇腈裂解酶的基因序列并驗(yàn)證了其表達(dá)規(guī)律和功能，同時(shí)發(fā)現(xiàn)木薯基因組中存在至少7個(gè)編碼該酶的基因，但確切的有幾個(gè)基因編碼并不清楚[4， 8-10]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者分別對(duì)5個(gè)木薯材料的基因組進(jìn)行了測(cè)序與基因組注釋，并對(duì)100多份栽培品種進(jìn)行了重測(cè)序[11-13]。序列注釋表明，木薯基因組中存在11個(gè)HNL基因成員，串聯(lián)分布在12號(hào)和13號(hào)染色體上。在對(duì)‘華南8號(hào)木薯品種重測(cè)序序列進(jìn)行分析時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)編號(hào)為12G132600的基因在編碼區(qū)內(nèi)部存在一個(gè)單堿基突變，即SNP，該SNP的出現(xiàn)使編碼精氨酸的CGA突變成終止密碼TGA，理論上該基因編碼的蛋白質(zhì)長度縮短了30%左右。從結(jié)構(gòu)上分析，該短的蛋白序列包含121～165位的底物識(shí)別和結(jié)合區(qū)域，也包含第80位的絲氨酸催化位點(diǎn)，但缺少第208位的天冬氨酸和第236位的組氨酸這2個(gè)起催化作用的位點(diǎn)。因此，該突變屬于自然突變，可能使基因喪失功能，利用該突變?yōu)榻档湍臼須淝杷岫拘蕴峁┝艘环N可能途徑。

本研究對(duì)251份木薯材料的重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，重點(diǎn)研究12G132600基因編碼區(qū)內(nèi)部的終止突變，并對(duì)食用木薯品種‘華南9號(hào)的12G132600基因進(jìn)行克隆和Sanger測(cè)序，驗(yàn)證重測(cè)序的結(jié)果，旨在了解木薯種質(zhì)群體中該醇腈裂解酶基因編碼區(qū)終止突變的分布狀況，為利用該基因培育低氫氰酸品種提供有用信息。

1? 材料與方法

1.1? 材料

木薯群體重測(cè)序數(shù)據(jù)包括241份國外已發(fā)表文章的材料[14]，另外還對(duì)10份引進(jìn)的木薯種質(zhì)材料進(jìn)行了重測(cè)序，一共251份。包括栽培品種（系）、木薯野生亞種（Manihot esculenta ssp. flabellifolia）和在進(jìn)化上與木薯栽培類型較近的野生種（Manihot glaziovii）。國外測(cè)序材料中，栽培品種（系）共217份，野生亞種flabellifolia的材料13份，野生種Manihot glaziovii有11個(gè)。本研究進(jìn)行重測(cè)序的材料有10個(gè)，即‘GR4‘HB60‘Mianbaomushu‘NZ199‘SC10‘R3‘SC6068‘SC9（‘華南9號(hào)）‘Wenchang?hon?gxin‘Yinniyeshengzhong。其中‘Yinniyes?he?ngzhong為野生種Manihot glaziovii，采自巴西Bahil省，其余9份材料屬栽培類型，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)所試驗(yàn)田。251份分析材料的種、亞種及地理來源等信息見表1。

1.2? 方法

1.2.1? 木薯種質(zhì)重測(cè)序數(shù)據(jù)及單核苷酸多態(tài)性（SNP）提取? 國外已發(fā)表木薯重測(cè)序數(shù)據(jù)從網(wǎng)站ftp：//ca?s?s?-avabase.org/HapMapII/WGSseq/下載。本研究的10份木薯材料首先利用艾萊德公司新型植物基因組DNA提取試劑盒提取高質(zhì)量基因組DNA，送諾禾致源公司進(jìn)行建庫和測(cè)序。

重測(cè)序數(shù)據(jù)利用BWA軟件[15]進(jìn)行基因組比對(duì)，然后利用SAMtools v1.4[16]及BCFtools v1.9[17]軟件進(jìn)行SNP提取。

1.2.2? ‘華南9號(hào)木薯12G132600基因的克隆測(cè)序? 木薯基因組有11個(gè)α-醇腈裂解酶基因，序列相似度高，為了克隆到12G132600基因，在基因的編碼區(qū)上游和下游各成員非保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，特異性擴(kuò)增12G132600基因。所用引物為HNL-1L（5′-GCAGCTGGCCACAAGGTT-AC-3′），HNL-1R（5′-TTTCTGGAAGGCGATGG-AGTT- 3′）;另一對(duì)引物為HNL-2L（5′-TGTTGCC-ATT-GC?T?G???CTGATAAA-3′），HNL-2R（5′-TGGAA- ?GG?CG?A?T?GGAGTTGC-3′）。擴(kuò)增條件為：（1）95 ℃變性5 min;（2）95 ℃變性30 s;（3）53 ℃復(fù)性45 s;（4）72 ℃延伸1.5 min;（5）72 ℃延伸10 min;（6）4 ℃保存。第2步到第4步循環(huán)34次。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒（Omega生物技術(shù)有限公司）回收，末端加A后用T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑克隆送上海生工生物公司測(cè)序。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 木薯群體重測(cè)序數(shù)據(jù)中α-醇腈裂解酶基因的變異情況

文獻(xiàn)中測(cè)序的木薯品種‘華南8號(hào)中α-醇腈裂解酶基因HNL發(fā)生編碼區(qū)提前終止突變的是編號(hào)為12G132600的基因。在最新V7.0版木薯AM560基因組上，突變位點(diǎn)發(fā)生在12號(hào)染色體33277058位點(diǎn)處（圖1A）。圖1A顯示該基因有2個(gè)內(nèi)含子，終止突變發(fā)生在第3個(gè)外顯子上，在編碼區(qū)的2/3長度處。通過SNP提取，我們測(cè)序的10份材料中只有SC9發(fā)生了同樣的終止突變（圖1B）。在SC9重測(cè)序結(jié)果中，覆蓋到該突變位點(diǎn)的測(cè)序reads數(shù)為22，在22條reads中，有10條在33277058位點(diǎn)與AM560相同，另12條則發(fā)生C->T的點(diǎn)突變（圖1B箭頭所示）。

另外檢測(cè)的241份國外材料中，有59份材料與SC8、SC9在該位點(diǎn)的突變情況相同，即都發(fā)生了G->A的突變，對(duì)應(yīng)密碼子則發(fā)生了CGA-> TGA的終止突變（表2）。

2.2? 木薯品種‘華南9號(hào)12G132600基因的克隆與測(cè)序

二代測(cè)序因?yàn)榧夹g(shù)原因，測(cè)序結(jié)果可能發(fā)生一定錯(cuò)誤，尤其在測(cè)序覆蓋度不高的情況下更是如此。本研究分析的測(cè)序深度都在10倍覆蓋度以上，而且在251份木薯材料中有近1/4的材料都在該位點(diǎn)有相同SNP檢出，這說明了分析數(shù)據(jù)的可靠性。然而，我們自己實(shí)驗(yàn)室對(duì)‘華南8號(hào)（SC8）木薯品種進(jìn)行了重測(cè)序和10×Genomics測(cè)序，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，在12G132600基因相同位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)變異，與國外所測(cè)結(jié)果不同。為進(jìn)一步證明木薯群體中12G132600基因編碼區(qū)內(nèi)部存在終止突變的真實(shí)性，本研究對(duì)‘華南9號(hào)木薯品種中的該基因用高保真酶擴(kuò)增，TA克隆后采用Sanger法進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證該變異的真實(shí)性。以設(shè)計(jì)的2對(duì)引物對(duì)‘華南9號(hào)和‘華南8號(hào)進(jìn)行擴(kuò)增后得到了目標(biāo)大小的條帶（圖2A）。隨后采用效果更理想的第1對(duì)引物對(duì)‘華南9號(hào)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，隨機(jī)挑選6個(gè)克隆送樣測(cè)序，其中3個(gè)測(cè)序結(jié)果證明了該突變確實(shí)存在（圖2B，第742位），另3個(gè)克隆則無突變。

2.3? 木薯品種‘TME312G132600基因序列分析

國外學(xué)者已對(duì)木薯品種‘TME3的基因組進(jìn)行了測(cè)序和組裝[13]，本研究利用木薯‘AM560的12G132600基因編碼區(qū)序列與‘TME3基因組進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，序列比對(duì)最好的位置在‘TME3基因組的Scaffold7上，編碼區(qū)從位點(diǎn)25931695到位點(diǎn)25932635。第3個(gè)開放閱讀框區(qū)的比對(duì)結(jié)果見圖3。其中‘TME3Scaffold7上25931919處的序列堿基為T（圖3箭頭所指），正是本研究發(fā)現(xiàn)的提前終止突變位置。‘TME3的基因組序列為國外學(xué)者獨(dú)立組裝，驗(yàn)證了本研究發(fā)現(xiàn)的12G132600基因編碼區(qū)內(nèi)部存在終止突變的結(jié)果。

3? 討論

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的動(dòng)植物基因組將被測(cè)序。當(dāng)一個(gè)物種有了參考基因組后，通過價(jià)格便宜的高通量測(cè)序，就可以發(fā)現(xiàn)物種內(nèi)部大量的遺傳變異，這些遺傳變異對(duì)于理解該物種內(nèi)功能基因的多樣性、重要性狀的演化規(guī)律等非常重要。目前已經(jīng)在水稻、玉米、棉花等多種作物中都進(jìn)行了相關(guān)的研究，不僅發(fā)現(xiàn)了基因內(nèi)部以及基因間存在的大量的遺傳變異，更重要的是找到了與重要性狀關(guān)聯(lián)的變異。相比于Genotyping by sequencing等簡化重測(cè)序方法，全基因組重測(cè)序的覆蓋度更高（通常在10倍以上），覆蓋基因組區(qū)域的范圍更廣，因此所得到的變異的可靠性更強(qiáng)。本研究所發(fā)現(xiàn)的木薯群體基因組中α-醇腈裂解酶基因編碼區(qū)內(nèi)部存在提前終止突變，正是通過重測(cè)序發(fā)現(xiàn)的，且在‘華南9號(hào)木薯品種中的Sanger測(cè)序也證實(shí)了重測(cè)序的可靠性?？梢哉f，重測(cè)序技術(shù)是后基因組時(shí)代研究物種群體遺傳學(xué)的有力工具。

木薯屬共有90多個(gè)物種[18]，在M. esculenta這個(gè)種內(nèi)，包括栽培類型亞種（M. esculenta ssp esculenta）和野生類型亞種（M. esculenta ssp flabellifolia），現(xiàn)在普遍認(rèn)為栽培類型的木薯是由野生亞種馴化而來。其余的種都為野生型，其中與栽培木薯親緣較近的野生種是M. glaziovii。本研究所分析的251份木薯種質(zhì)中，包括栽培類型的木薯種質(zhì)213份，木薯近緣野生亞種（M. esculenta ssp flabellifolia）16份，另還有9份野生種M. glaziovii和13份野生栽培雜交種材料。值得指出的是，α-醇腈裂解酶基因編碼區(qū)存在終止突變的60份材料均為栽培類型。說明該變異是在木薯從野生亞種馴化成栽培類型以后才出現(xiàn)的。當(dāng)然，由于野生種及野生亞種的材料數(shù)較少，該結(jié)果需要進(jìn)一步擴(kuò)大群體進(jìn)行證實(shí)。另外，所有檢測(cè)到含終止突變的栽培木薯材料均為雜合基因型，即有一個(gè)未突變的等位基因與突變基因同時(shí)存在。這可能是該基因在某些特定組織或在特定發(fā)育時(shí)期表達(dá)，不能完全突變，突變基因純合的狀況對(duì)植物的保護(hù)作用大大減弱，不利于木薯對(duì)病蟲害等傷害的抵御。

實(shí)踐證明，通過基因組重測(cè)序，可以在物種內(nèi)不同種質(zhì)材料間發(fā)現(xiàn)大量的遺傳變異，包括單核苷酸多態(tài)性和插入缺失等各種變異，并為此開發(fā)了ANNOVAR[19]等一些生物學(xué)軟件來對(duì)重測(cè)序數(shù)據(jù)中的變異的功能進(jìn)行注釋。目前的基因組測(cè)序與注釋表明木薯基因組上存在11個(gè)HNL基因家族的成員，這11個(gè)成員分別串聯(lián)分布在第12號(hào)和13號(hào)染色體上[10]。其中，13G092100編碼的氨基酸序列與已發(fā)表的經(jīng)過功能驗(yàn)證的MeHNL10同源性達(dá)100%，應(yīng)該是同一個(gè)基因[8]，國內(nèi)學(xué)者王丹等[9]及程樹華等[10]克隆的木薯醇腈酶基因經(jīng)過序列比對(duì)及進(jìn)化分析，事實(shí)上也應(yīng)該是HNL10的等位基因。其他的成員（包括12G132600）在結(jié)構(gòu)上具有與α-醇腈裂解酶相同的結(jié)構(gòu)域，但其功能尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以看出，這11個(gè)成員中有5個(gè)在葉片和塊根組織中有表達(dá)，12G132600是其中之一（結(jié)果未發(fā)表）。由于本研究發(fā)現(xiàn)的突變發(fā)生在編碼區(qū)，會(huì)導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)長度縮短30%左右。從結(jié)構(gòu)上分析，該短的蛋白序列包含底物識(shí)別和結(jié)合區(qū)域，也包含絲氨酸催化位點(diǎn)，但缺少C端的天冬氨酸和組氨酸這2個(gè)起催化作用的位點(diǎn)。有報(bào)道指出，結(jié)構(gòu)相似的同工酶之間可通過競(jìng)爭(zhēng)底物的方式相互產(chǎn)生干擾[20]。該突變基因表達(dá)的蛋白能否結(jié)合底物以及是否具有催化活性，在表達(dá)時(shí)能否和正常未突變的α-醇腈裂解酶存在底物競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系，這是非常值得研究的。如果該突變蛋白能和底物結(jié)合，但沒有催化活性，那么其在體內(nèi)大量表達(dá)時(shí)便會(huì)與正常的α-醇腈裂解酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合底物，從而阻止α-醇腈裂解產(chǎn)生氫氰酸，這樣即可一定程度避免人類、動(dòng)物等在食用木薯時(shí)受到氫氰酸的毒害。

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責(zé)任編輯：崔麗虹