唐青霞 綜述 趙月萍 審校

暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632

如何促進(jìn)牙槽骨缺損的修復(fù)是臨床上關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，臨床上針對牙槽骨的修復(fù)再生主要是通過骨移植、引導(dǎo)性骨再生等方法，但這些方法因手術(shù)適應(yīng)證不同、手術(shù)技術(shù)的復(fù)雜程度不同而表現(xiàn)出其固有的局限性[1]。以組織工程學(xué)為基礎(chǔ)的治療策略，為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，包括生長因子、種子細(xì)胞、生物支架，為牙槽骨修復(fù)提供新的治療策略[2-3]。轉(zhuǎn)化生長因子-β3(transforming growth factor-β3，TGF-β3)是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員之一，已有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，TGF-β3不僅僅是軟骨組織工程的理想細(xì)胞因子之一，其可以通過軟骨內(nèi)骨化途徑促進(jìn)骨內(nèi)修復(fù)[4]。本文對TGF-β3在誘導(dǎo)牙源性干細(xì)胞成骨分化和相關(guān)信號通路方面的最新研究做一綜述。

1 TGF-β3生物學(xué)功能和應(yīng)用

外源性生長因子在骨組織再生過程中發(fā)揮著重要作用。TGF-β作為一種重要的骨生長調(diào)控因子，同時促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長和抑制破骨細(xì)胞的形成。轉(zhuǎn)化生長因子是一種具有多種生物學(xué)功能的多肽生長因子超家族，它在各種生理病理中起著重要作用，例如細(xì)胞生長和分化、基質(zhì)形成、機(jī)體免疫、損傷修復(fù)、軟骨和骨的形成、免疫調(diào)節(jié)等。TGF-β家族可分為許多亞家族，其中TGF-β亞家族包括了TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三種TGF-β之間的核酸序列具有高度的同源性[5]。實(shí)驗(yàn)研究表明，TGF-β3與骨形態(tài)蛋白聯(lián)合后在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化時的雙向調(diào)控作用更加持久[6]。

TGF-β3已在體內(nèi)用于軟骨修復(fù)、組織再生和傷口愈合[7-9]，并促進(jìn)基質(zhì)形成、免疫和維持干細(xì)胞特性[10]。TGF-β3能促進(jìn)MSCs向增殖和早期分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞[5]。TGF-β3能誘導(dǎo)軟骨內(nèi)骨形成[11]，并完成骨重建[12]，也可招募內(nèi)源性MSCs啟動骨再生[13]。近幾年來，TGF-β3逐漸被用于誘導(dǎo)牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，因此，TGF-β3可被認(rèn)為是修復(fù)牙槽骨缺損的選擇性生物活性分子。

2 TGF-β3誘導(dǎo)牙源性干細(xì)胞成骨分化的作用

牙源性干細(xì)胞包括了牙周來源的間充質(zhì)干細(xì)胞和牙髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，被認(rèn)為是骨再生過程中的關(guān)鍵細(xì)胞。牙源性干細(xì)胞在牙槽骨損傷修復(fù)中表現(xiàn)突出，是優(yōu)于其他體細(xì)胞來源的干細(xì)胞[14]。牙源性干細(xì)胞被定義為具有自我更新能力和多向分化潛能。其中，牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞因臨床潛力大而被廣泛用于骨再生的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究。在適宜的誘導(dǎo)條件下可以分化成為多種組織細(xì)胞，包括成牙本質(zhì)細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等，是口腔組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最重要的種子細(xì)胞[15]。TGF-β3對牙源性干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用主要以成軟骨向和成骨向兩個方向?yàn)橹鱗16]。

麥麥提依明·哈力克等[17]研究表明，TGF-β3與肝素聯(lián)合作用，可在無支架材料環(huán)境中可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞成骨方向的分化，并可以防止TGF-β3受蛋白酶水解及化學(xué)性失活，從而保護(hù)其活性，并能發(fā)揮更好的生物學(xué)作用。并發(fā)現(xiàn)在恒定磁場(static magneticfield，SMF)作用下，能提高牙髓干細(xì)胞氧代謝水平，形成了高濃度氧代謝環(huán)境，從而增強(qiáng)了TGF-β3對牙髓干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化能力[18]。王騰等[19]將牙髓干細(xì)胞聯(lián)合外源性TGF-β3置于兔骨缺損區(qū)，增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的生長分化和增殖效率，并能加速新骨形成。一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)研究表明，TGF-β3在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對牙周膜干細(xì)胞增殖沒有影響，但能促進(jìn)其成骨分化。將其負(fù)載與殼聚糖海綿上可以有效的促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨向分化[4]，其相關(guān)治療機(jī)制及在構(gòu)建牙槽骨骨修復(fù)材料方面仍在深入研究中。

3 TGF-β3誘導(dǎo)牙槽骨修復(fù)的成骨方式

骨損傷的修復(fù)方式包括膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。膜內(nèi)成骨方式是先由間充質(zhì)分化成為胚性結(jié)締組織膜，然后在該膜中骨化。在整個骨修復(fù)過程中沒有軟骨骨痂的生成，而是直接由干細(xì)胞分化成熟為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)將缺損修復(fù)。軟骨內(nèi)成骨的骨修復(fù)過程如下，首先由軟骨細(xì)胞增生肥大，軟骨基質(zhì)鈣化，致使軟骨細(xì)胞退化死亡，隨著軟骨和骨細(xì)胞的侵入，新生血管長入，骨祖細(xì)胞形成成骨細(xì)胞并分泌鈣化的軟骨基質(zhì)，從而最終完成骨的修復(fù)過程。

UGO RIPAMONTI教授團(tuán)隊(duì)開展TGF-β3在牙骨質(zhì)和骨發(fā)育形成中的功能研究已有將近20年的歷史，從2006年至今在《Biomaterials》等發(fā)表了多篇高水平的研究論文[20-21]，而且一直在持續(xù)更新進(jìn)展。除此，在靈長類動物狒狒下頜第一、第二磨牙牙周骨缺損模型也證實(shí)TGF-β3顯著誘導(dǎo)了骨的形成[22]。但相關(guān)理論和機(jī)制并沒有得到清楚的解釋和闡述，從動物實(shí)驗(yàn)到人的應(yīng)用還有許多待解決的科學(xué)問題。在對異位骨化(HO)疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，TGF-β3可能是HO的誘因，而HO是通過軟骨內(nèi)骨化發(fā)生發(fā)展起來的。其可能機(jī)制是：首先免疫細(xì)胞在受損部位聚焦釋放TGF-β3，然后軟骨細(xì)胞增殖、肥大并礦化；此后活性的TGF-β3招募MSPCs與Nestin+的H型血管共同促進(jìn)了新生骨的形成[23]。2020年新發(fā)表在Nature的文章對血管缺乏涉及的脂質(zhì)代謝和骨骼祖細(xì)胞的命運(yùn)進(jìn)行了深入探討，指出微小血管的形成及營養(yǎng)運(yùn)輸對軟骨內(nèi)成骨非常重要，該文章為軟骨內(nèi)成骨的機(jī)制研究提供了新的證據(jù)[24]。這些研究表明，TGF-β3誘導(dǎo)軟骨內(nèi)骨化途徑可能刺激體內(nèi)骨的形成。現(xiàn)有技術(shù)手段和理論認(rèn)為牙槽骨主要通過膜內(nèi)成骨的方式進(jìn)行成骨，TGF-β3誘導(dǎo)骨再生機(jī)制屬于“軟骨內(nèi)成骨”，應(yīng)用TGF-β3進(jìn)行牙槽骨再生修復(fù)將是一種新的研究策略。

4 TGF-β3誘導(dǎo)牙槽骨修復(fù)的信號通路

轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族信號在多種生物系統(tǒng)中調(diào)控細(xì)胞生長、分化和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在成骨分化和骨再生過程中，TGF-β3介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特異性通過典型的Smad依賴通路(TGF-β配體、受體和Smad)和非典型的Smad獨(dú)立信號通路(如p38 MAPK通路)發(fā)生[25]。

4.1 TGF-β3受體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 目前已明確TGF-β3的特異性受體有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅰ型受體和Ⅱ型受體都屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，Ⅱ型受體決定受體的反應(yīng)特異性。在無Ⅰ型受體的情況下，Ⅱ型受體主要與TGF-β1和TGF-β3高親和力結(jié)合，而不與TGF-β2結(jié)合[26]。Ⅲ型受體本身不參與信號傳導(dǎo)，作為一種輔助受體，間接調(diào)節(jié)TGF-β1與受體結(jié)合的過程。近期報道中，評估了可溶性轉(zhuǎn)化生長因子β受體3(TgfβR3)在誘導(dǎo)人骨源性成骨細(xì)胞樣細(xì)胞增加礦化中的作用，證實(shí)了TgfβR3信號可誘導(dǎo)骨前體成骨[27]。Smad蛋白是TGF-β家族受體下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。根據(jù)在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能差異，其被分為三類：包括受體調(diào)控型或通路限制型(R-Smad)：Smad1/2/3/5/8；共同通用型(Co-Smad)：Smad4；抑 制 型(I-Smad)：Smad6/7[26]。通常來說，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)始于配體誘導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸受體激酶的寡聚化，以及TGF-β/激活素途徑中的細(xì)胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad2/3和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)途徑中的Smad1/5/9磷酸化[28-30]。在公認(rèn)的TGF-β誘導(dǎo)Smad激活后，導(dǎo)致Smad介導(dǎo)基因表達(dá)的模型中：TGF-β二聚體與Ⅱ型TβRII結(jié)合，導(dǎo)致TβRI募集到異構(gòu)體受體復(fù)合體中，使TβRI的GS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)磷酸化。隨后激活的TβRI通過C-末端絲氨酸的磷酸化激活Smad2和Smad3，這些受體激活的R-Smads與Smad4結(jié)合，形成Smad三聚體進(jìn)入細(xì)胞核，并與靶基因Smad結(jié)合的調(diào)控DNA序列上的其他輔助轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而直接激活或抑制靶基因的表達(dá)[31]。

4.2 TGFβ-Smads信號通路 TGFβ-Smads信號通路促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖、趨化和早期分化。同時，它也抑制成骨細(xì)胞的成熟、礦化和向骨細(xì)胞過渡。通過降低RANKL/OPG分泌比例抑制破骨細(xì)胞分化，但通過直接結(jié)合破骨細(xì)胞上的受體促進(jìn)破骨細(xì)胞發(fā)生。Smad2和Smad3具有雙向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化和軟骨細(xì)胞內(nèi)骨化。Smad2/3抑制Runx2的表達(dá)，激活的Smad3也招募Ⅱ類組蛋白去乙?；?HDACs)4和5來抑制Runx2的功能，在缺乏Smad3的情況下，TGF-β不能再抑制成骨細(xì)胞的分化[32-34]。TGF-β-Smad3雖然負(fù)調(diào)控成骨細(xì)胞的發(fā)生，但也抑制成骨細(xì)胞凋亡和向成骨細(xì)胞分化[35]。因此，Smad3缺失大鼠的骨質(zhì)減少與骨細(xì)胞數(shù)量增加和細(xì)胞凋亡相關(guān)。成骨細(xì)胞受到機(jī)械力刺激時細(xì)胞數(shù)目增加，同時TGF-β的表達(dá)亦增加。在大鼠腭中縫牽張成骨實(shí)驗(yàn)中，驗(yàn)證了在應(yīng)力刺激下成骨細(xì)胞TGF-β1、TGF-β2的高表達(dá)使其增殖指數(shù)上升，而TGF-β3呈低表達(dá)狀態(tài)。Smad4作為唯一的通用型Smad分子，是TGFβ信號通路的中心介導(dǎo)者。TGF-β3在體外促進(jìn)rDPSCs的成骨向分化實(shí)驗(yàn)中，不同時間點(diǎn)Smad4呈高表達(dá)趨勢，但Smad2/3復(fù)合物及相關(guān)Smad蛋白是否參與到TGF-β3誘導(dǎo)的rDPSCs成骨還尚未見報道[36]。

4.3 TGFβ-p38MAPK信號通路 p38MAPK(α、β、γ和δ)是MAPK家族的成員，各種環(huán)境應(yīng)激和炎癥細(xì)胞因子均可將其激活。多項(xiàng)研究表明，PDLSCs通過p38MAPK信號通路進(jìn)行成骨分化[37-39]。研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β3誘導(dǎo)PDLSCs后，TGF-β3與TβRⅠ/Ⅱ受體結(jié)合后，啟動p38磷酸化后入細(xì)胞核促進(jìn)RUNX2的表達(dá)，從而促進(jìn)hPDLSCs的成骨分化，但其上下游分子機(jī)制不明[4]。RUNX2在協(xié)同參與成骨細(xì)胞分化的多種信號方面發(fā)揮重要作用，是成骨分化和骨形成所必需的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子，也是細(xì)胞成骨分化過程中最早持續(xù)表達(dá)的蛋白，標(biāo)志著成骨分化的開始。TGF-β3誘導(dǎo)牙源性干細(xì)胞成骨分化的p38 MAPK信號通路，多數(shù)學(xué)者認(rèn)同以下觀點(diǎn)：TGF-β3激活特異性Ⅰ型、Ⅱ型受體并與之相互作用，形成受體復(fù)合物，并將信號傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，使得細(xì)胞內(nèi)的TAK1被激活，TAK1再激活并磷酸化MKK3/6，進(jìn)一步激活下游的P38MAPK，后者可直接進(jìn)入細(xì)胞核，從而磷酸化激活RUNX2，影響細(xì)胞因子的釋放并上調(diào)相關(guān)的成骨相關(guān)基因表達(dá)，促使干細(xì)胞成骨分化。

5 結(jié)語

牙槽骨缺損修復(fù)是臨床上最常見的棘手問題，對于牙槽骨的功能性保存與修復(fù)再生是十分必要的。轉(zhuǎn)化生長因子家族在骨組織工程修復(fù)中起著重要的作用，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TGF-β3具有促進(jìn)骨軟骨細(xì)胞軟骨分化的能力，是軟骨組織工程的理想細(xì)胞因子之一。將TGF-β3作為牙槽骨修復(fù)的細(xì)胞因子，是骨向修復(fù)而不是軟骨，突破了TGF-β3慣常的理論，將是一種新的策略。本文分析了TGF-β3能誘導(dǎo)的牙源性干細(xì)胞成骨分化的作用以及兩條重要途徑——Smads信號通路和p38MAPK信號通路，但是在其他信號通路的作用及相關(guān)通路之間的聯(lián)系目前尚不清楚。TGF-β3用于與牙槽骨缺損修復(fù)的應(yīng)用研究的相關(guān)理論和機(jī)制并沒有得到完全清楚的解釋和闡述，從動物實(shí)驗(yàn)到人的應(yīng)用還有許多待解決的科學(xué)問題，可望形成新的治療策略，為骨組織工程的研究提供新思維。