李文明，馬建倉(cāng)，雷玉明，邢會(huì)琴，尚立琪

（1張掖市玉米原種場(chǎng)，甘肅張掖 734024；2河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生態(tài)工程學(xué)院，甘肅張掖 734000）

0 引言

甘肅省河西走廊，具有得天獨(dú)厚的自然優(yōu)勢(shì)，其光熱資源充足、土地肥沃、灌溉便利、交通發(fā)達(dá)，天然隔離條件好，是國(guó)內(nèi)玉米優(yōu)良品種選育、雜交種子生產(chǎn)和貯藏的理想場(chǎng)所。近年來(lái)，河西地區(qū)吸引了全國(guó)育種專(zhuān)家在此培育優(yōu)良新品種，同時(shí)，也吸引了全國(guó)各大玉米制種公司在此區(qū)域落地生根，使玉米制種產(chǎn)業(yè)得到了迅速發(fā)展。目前，河西走廊玉米制種面積已穩(wěn)定在10萬(wàn)hm2左右，占全國(guó)玉米種子生產(chǎn)的50%左右，現(xiàn)已發(fā)展成為全國(guó)規(guī)模最大的玉米雜交種子生產(chǎn)基地[1]。由于常年大面積種植玉米，輪作倒茬困難，玉米制種田病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，使得種子帶菌率升高，嚴(yán)重影響了種子產(chǎn)量和品質(zhì)。高曉梅等[2]報(bào)道了遼寧省玉米種子攜帶的真菌達(dá)16屬26種，龍書(shū)生等[3]鑒定出陜西關(guān)中西部玉米穗粒腐病病穗籽粒表面和內(nèi)部寄藏的真菌有11屬14種。邢會(huì)琴等[4]對(duì)河西走廊當(dāng)年收獲以及儲(chǔ)存1～12年的11份種樣真菌區(qū)系進(jìn)行了研究，從種子內(nèi)部和表面共檢出10屬16種真菌。雷玉明等[5]以河西走廊玉米制種基地生產(chǎn)的種子為研究對(duì)象，從當(dāng)?shù)刂品N企業(yè)新收獲的50個(gè)玉米品種（組合）種樣中共檢出真菌10個(gè)屬。國(guó)內(nèi)多地對(duì)玉米種子帶菌檢驗(yàn)認(rèn)為，玉米種子帶菌不僅造成遠(yuǎn)距離傳播危害，而且也是影響種子活力下降的重要因素。目前，因種子帶菌引起的玉米制種田病害主要有大斑病、小斑病[6-7]、絲黑穗病[8]、莖腐病[9-10]、灰斑病[11]、頂腐病[12]等。針對(duì)種子帶菌引起的病害問(wèn)題，在生產(chǎn)上多采取的是以摸清種子帶菌情況，加強(qiáng)種子消毒或包衣，選用無(wú)菌種子為主，結(jié)合提高栽培管理水平和藥劑防治的綜合防治措施。這些方法對(duì)種子表面攜帶的真菌效果較好，但對(duì)種子內(nèi)部攜帶的真菌沒(méi)有明顯效果，為此，本文研究了不同溫度對(duì)種子內(nèi)部攜帶真菌的影響，旨在尋找既能減少種子帶菌率，又不影響種子發(fā)芽的適宜溫度，為玉米種傳病害的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試玉米品種（系）：自交系‘鄭58’，由張掖市玉米原種場(chǎng)提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理 試驗(yàn)設(shè)5個(gè)溫度梯度：30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)處理時(shí)間，即10、20、30 min，共15個(gè)處理。隨機(jī)挑選大小均勻、無(wú)損傷、無(wú)明顯霉變的供試玉米種子，裝入150 mL三角瓶中，每瓶60粒，共45瓶。分別放在已經(jīng)設(shè)置好溫度的水浴鍋中恒溫處理至設(shè)定時(shí)間后取出，自然降溫至室溫待用，每處理3個(gè)重復(fù)，對(duì)照組不做任何處理。

1.2.2 不同溫度對(duì)玉米種子內(nèi)藏真菌的影響 采用PDA培養(yǎng)法[13]，將上述處理過(guò)的每份玉米種樣隨機(jī)取30粒，在5%NaClO溶液中浸泡3 min后，立即用無(wú)菌水沖洗3次，用滅菌濾紙吸干種子表面的水分后每皿放置10粒，均勻擺放在直徑為90 mm的PDA平板培養(yǎng)基上，每個(gè)處理重復(fù)3次，對(duì)照是沒(méi)有經(jīng)溫度處理的種子，于25℃恒溫培養(yǎng)5～7天，從第2天開(kāi)始觀察記錄真菌種類(lèi)，并計(jì)算種子帶菌率，見(jiàn)公式(1)。某菌帶菌率的計(jì)算見(jiàn)公式(2)。

1.2.3 不同溫度對(duì)玉米種子發(fā)芽的影響 采用濾紙培養(yǎng)法[14]，將上述用不同溫度和時(shí)間處理的種子，隨機(jī)選取30粒，用5%的NaClO溶液浸種5 min后，立即用無(wú)菌水沖洗3次，均勻擺放在90 mm培養(yǎng)皿（雙層滅菌濾紙加無(wú)菌水浸濕）中，每皿10粒，3次重復(fù)，對(duì)照是沒(méi)有經(jīng)溫度處理的種子。于25℃、相對(duì)濕度40%、8 h光照與16 h黑暗交替恒溫恒濕培養(yǎng)，在第4天和第7天分別統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽情況，并計(jì)算種子發(fā)芽勢(shì)(GE)、發(fā)芽率(GP)和發(fā)芽指數(shù)(GI)，分別見(jiàn)公式(3)、(4)、(5)。

其中Gt為t時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽時(shí)間。

1.2.4 菌種的純化培養(yǎng)與鑒定 用PDA培養(yǎng)法培養(yǎng)的種子，待種子周?chē)L(zhǎng)出菌絲體或種子表面出現(xiàn)霉層時(shí)，將其輕輕挑取并移至PDA平板上進(jìn)行初步純化，經(jīng)多次反復(fù)純化培養(yǎng)后，將其轉(zhuǎn)管保存于4℃冰箱備用。

將分離獲得的真菌菌株在PDA平板上培養(yǎng)3～5天后，觀察菌落特征和培養(yǎng)性狀，并制片鏡檢觀察菌絲、孢子等菌體形態(tài)特點(diǎn)，參考《真菌鑒定手冊(cè)》[15]和有關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行分類(lèi)鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel作圖，SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度處理對(duì)玉米種子內(nèi)藏真菌的影響

經(jīng)不同溫度和時(shí)間處理的種子，在PDA平板上培養(yǎng)3～7天后可見(jiàn)有霉層出現(xiàn)，經(jīng)純化培養(yǎng)，共檢出曲霉屬 (Aspergillus)、青 霉 屬 (Penicillium)、根 霉 屬(Rhizopus)、鐮孢屬(Fusarium)、鏈格孢屬(Alternaria)5個(gè)屬的真菌和1種未知真菌。各處理之間從種子內(nèi)部檢出的真菌種類(lèi)和數(shù)量存在明顯差異(P<0.05)，而且種子總帶菌率隨溫度升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)總體具有下降趨勢(shì)，帶菌種類(lèi)和數(shù)量也明顯減少。30℃和35℃處理過(guò)的種子，共檢出5個(gè)屬和1個(gè)未知真菌，真菌種類(lèi)最多，3個(gè)時(shí)間段的種子總帶菌率相對(duì)較高，均在16.7%～23.3%%之間，其中曲霉屬和青霉屬的平均帶菌率明顯高于對(duì)照(P<0.05)；40℃和45℃處理過(guò)的種子，共檢出4個(gè)屬的真菌，未檢出鏈格孢屬和未知菌，各處理的種子總帶菌率顯著低于對(duì)照(P<0.05)，青霉屬和鐮孢霉屬的種子帶菌率也明顯低于對(duì)照(P<0.05)；50℃處理過(guò)的種子，共檢出3個(gè)屬的真菌，未檢出根霉屬、鐮孢霉屬和鏈格孢屬，而且3個(gè)時(shí)間段的種子帶菌率均顯著低于對(duì)照(P<0.05)，在3.3%～6.7%之間，種子總帶菌率、曲霉屬和青霉屬的帶菌率菌明顯低于對(duì)照和其他處理(P<0.05)。

2.2 不同溫度和處理時(shí)間對(duì)玉米種子發(fā)芽的影響

2.2.1 不同溫度和處理時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，不同處理的種子發(fā)芽勢(shì)存在一定差異，其中30℃處理10 min和20 min，以及40℃處理30 min，種子發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照無(wú)明顯差異；30℃～40℃之間其他各時(shí)間段處理的種子，其發(fā)芽勢(shì)明顯高于對(duì)照(P<0.05)，35℃處理30 min最高達(dá)30.9%，其次是40℃處理20 min，發(fā)芽勢(shì)為28.8%；45℃～50℃范圍內(nèi)處理的種子，其發(fā)芽勢(shì)顯著低于對(duì)照和其他處理，均低于16.0%，50℃處理30 min的種子發(fā)芽勢(shì)最低達(dá)0%（圖1）。

圖1 不同溫度和處理時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)的影響

2.2.2 不同溫度和處理時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽率的影響 不同處理之間種子的發(fā)芽率存在一定差異，其中30℃～35℃之間各時(shí)間段處理的種子發(fā)芽率均高于92.0%，與對(duì)照無(wú)明顯差異；40℃處理10 min和20 min的種子，其發(fā)芽率在90.0%～91.0%之間，低于對(duì)照2～3個(gè)百分點(diǎn)，40℃處理30 min的種子發(fā)芽率下降至83.3%，明顯低于對(duì)照(P<0.05)；45℃～50℃處理的種子發(fā)芽率均在71.0%以下，顯著低于對(duì)照(P<0.05)，而且隨處理溫度的升高和時(shí)間延長(zhǎng)，種子發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)，直至50℃處理30 min，種子發(fā)芽率最低為0%（圖2）。

圖2 不同溫度和處理時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽率的影響

2.2.3 不同溫度和處理時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽指數(shù)的影響 不同處理間的種子發(fā)芽指數(shù)存在一定差異（圖3），其中30℃各時(shí)間段處理的種子，其發(fā)芽指數(shù)在3.1～3.3之間，與對(duì)照無(wú)明顯差異；35℃～40℃范圍內(nèi)，除40℃處理30 min的種子發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照無(wú)明顯差異外，其余各處理的發(fā)芽指數(shù)全部高于3.3，明顯高于對(duì)照(P<0.05)，對(duì)種子發(fā)芽具有促進(jìn)作用；45℃～50℃之間的各處理，其發(fā)芽指數(shù)在0～2.8之間，均顯著低于對(duì)照，而且發(fā)芽指數(shù)隨溫度升高和時(shí)間延長(zhǎng)呈逐減趨勢(shì)，直至50℃處理30 min的發(fā)芽指數(shù)達(dá)0。

圖3 不同溫度和處理時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽指數(shù)的影響

表1 不同溫度和時(shí)間處理對(duì)種子內(nèi)藏真菌的影響

3 討論

溫度處理種子一般采用溫湯浸種和干熱處理兩種方法，主要原理是利用種子與病原菌抗熱能力的不同用熱力將病原菌殺死[16]。因蔬菜種子比較耐高溫，因此利用高溫處理殺菌的方法主要應(yīng)用于蔬菜種子，如李寶聚等[17]對(duì)蔬菜種子進(jìn)行高溫(49℃～52℃)處理，可有效防治黃瓜炭疽病和蔓枯病，番茄早疫病、斑枯病和黑斑病，辣椒疫病和細(xì)菌性瘡痂病，以及茄子黃萎病、褐紋病和枯萎病等。孫學(xué)振等[18]的研究表明，30℃溫水浸種8～12 h，可減輕棉苗根病的發(fā)生。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在30℃～50℃范圍內(nèi)處理玉米種子后，種子均能帶菌，帶菌率在3.3%～23.3%之間，其中30℃～35℃處理10～30 min，種子帶菌率沒(méi)有明顯下降，而40℃～50℃處理10～30 min，可有效降低種子帶菌率33.5%～83.5%，總體表現(xiàn)為隨溫度升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)種子帶菌率呈下降趨勢(shì)，而且真菌種類(lèi)也顯著減少，可見(jiàn)，溫度越高，處理時(shí)間越長(zhǎng)，種子帶菌率越低，殺菌效果越好，這一結(jié)論與前人研究的結(jié)果保持一致。有資料顯示，玉米種子發(fā)芽的耐受最高溫度因品種和處理方式不同而存在一定差異。葉世青等[19]的研究表明，玉米種子發(fā)芽耐受相對(duì)水溫最高為45℃～55℃，氣溫最高可達(dá)65℃～85℃，且不同品種間的耐受溫度也不盡相同。本研究選擇自交系‘鄭58’作為試驗(yàn)材料，其耐受發(fā)芽溫度最高為50℃(30 min)，與前人的研究結(jié)果基本相符。但本研究只選擇了一個(gè)玉米品種（系）‘鄭58’（自交系）作為試驗(yàn)材料，而對(duì)于其他自交系、雜交種，以及甜、糯玉米等對(duì)溫度的耐熱程度與‘鄭58’是否存在差異，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。另外，本研究只是將溫度處理對(duì)種子的殺菌效果和發(fā)芽影響在室內(nèi)進(jìn)行了前期研究，對(duì)于田間試驗(yàn)將在后續(xù)進(jìn)行。

4 結(jié)論

在30℃～50℃溫度范圍內(nèi)處理玉米種子后，種子能均帶菌，但不同溫度和時(shí)間處理的種子帶菌率和真菌種類(lèi)存在一定差異，其中30℃～35℃之間，種子帶菌率無(wú)明顯變化，大于40℃，帶菌率隨溫度升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，真菌種類(lèi)也隨之減少。在30℃～50℃溫度范圍內(nèi)的種子發(fā)芽指標(biāo)也存在一定差異，其中30℃和35℃各時(shí)間段，以及40℃處理10～20 min，對(duì)種子的發(fā)芽影響不大，40℃處理30 min以及45℃～50℃各時(shí)間段的處理，其種子的發(fā)芽明顯受到抑制，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均顯著降低，而且隨溫度升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)呈急劇下降趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，40℃處理10～20 min，種子帶菌率能降低33.5%～50.0%，而且對(duì)種子的發(fā)芽影響不大，可用于播前種子處理，能有效降低種子內(nèi)藏真菌帶菌率，促進(jìn)種子發(fā)芽。