謝道龍，譚 智，李虹燁，付小俠，王 帆，劉曉霞,3，覃佐東,3，何福林,3，駱 鷹,3

（1湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南永州 425199；2湖南大學(xué)生物學(xué)院，長沙 410082；3湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，湖南永州 425199）

0 引言

在自然條件下，當(dāng)植物受到各種不利因素的侵害時(shí)，植物可以通過改變形態(tài)，關(guān)閉或下調(diào)一些非必要基因的表達(dá)，開啟或上調(diào)一些抵抗脅迫相關(guān)基因的表達(dá)等方面來將所受到的傷害盡可能降低。ASR(abscisic acid,stress,ripening-induced)基因作為植物體內(nèi)一種關(guān)鍵的響應(yīng)脅迫的調(diào)控基因，含ABA/WDS功能域，其長度介于34 aa～284 aa之間，且該基因與果實(shí)成熟過程和脫落酸脅迫下的適應(yīng)性調(diào)整密切相關(guān)[1]。當(dāng)ASR1基因首次在番茄(Lycopersicon escdenfum)中被發(fā)現(xiàn)后[2]，一些ASR基因也隨之在其他物種中得到分離鑒定，例如火炬松(Pinus taeda)[3]、鹽角草(Salicornia brachiata)[4]和葡萄(Vitis vinifera)[5]等，在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中卻未找到與ASR相似度較高的基因[6]。許多植物中的ASR基因組成基因家族，如芭蕉屬(Musa)的ASR基因成員有4個(gè)以上[7]，玉米(Zea mays)的ASR成員個(gè)數(shù)較多，存在9個(gè)[8]，番茄的ASR成員已被分離的就有5個(gè)[9]，而葡萄的ASR成員較少，只發(fā)現(xiàn)1個(gè)[5]，這說明各種植物的ASR基因家族成員數(shù)量存在差異。目前，有關(guān)植物ASR基因應(yīng)答非生物脅迫的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)ASR基因的擬南芥能夠較好的抵抗各種非生物脅迫如低溫、高鹽等[10]。香蕉(Musa nana)通過上調(diào)MpASR基因的表達(dá)而響應(yīng)甘露醇脅迫，MpASR基因在擬南芥中的過表達(dá)能顯著增強(qiáng)其對(duì)滲透脅迫的抵抗能力[11]。將海蓬子(Salicornia herbacea)SbASR1基因轉(zhuǎn)煙草，用高鹽溶液處理過表達(dá)株系，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞內(nèi)的鹽濃度較低，其種子生活力較高[12]。Virlouvet等[8]研究發(fā)現(xiàn)，玉米ZmASR1基因在應(yīng)答干旱脅迫時(shí)，通過作用于支鏈氨基酸的合成代謝而使玉米增產(chǎn)。ASR調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程中糖分子與ABA誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也有報(bào)道[13]；在香蕉雌花中有一個(gè)特異性表達(dá)的MaASR基因，轉(zhuǎn)基因植株能使開花時(shí)間延長[14]。因此，植物ASR基因在調(diào)控植物生長發(fā)育、生理活動(dòng)以及應(yīng)答逆境脅迫方面都具有十分重要的功能。

銀杏(Ginkgo biloba)被稱為“活化石”，是現(xiàn)存裸子植物中最古老的孑遺植物。在分類上銀杏屬落葉喬木，其雌花及雄花存在于同一種植物的不同植株上，屬國家二級(jí)保護(hù)植物，具有許多開發(fā)利用價(jià)值，尤其在生態(tài)利用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值方面比較突出[15]。近年來，人們對(duì)銀杏的分子生物學(xué)方面有了深入研究，如DNA甲基化修飾位點(diǎn)[16]，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及基因表達(dá)譜[17]，miRNA的功能鑒定[18-19]及代謝分析[20]等。據(jù)報(bào)道，中國可供農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面利用的土地中，有4.88%的鹽漬化土壤面積[15]。在冬季，許多地區(qū)經(jīng)常使用NaCl作為融雪劑進(jìn)行融雪，使得道路兩旁銀杏樹的生長與發(fā)育受到阻礙，甚至死亡。本研究對(duì)銀杏ASR基因進(jìn)行克隆，分析GbASR蛋白理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位及系統(tǒng)進(jìn)化等，還通過非生物脅迫實(shí)驗(yàn)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，對(duì)GbASR基因的功能進(jìn)行初步研究；這為中草藥的育種、ASR基因抗逆分子機(jī)理及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)以湖南省永州市桐子坳（地理坐標(biāo)為26°06′N，111°50′E）的銀杏成年植株以及收集同株銀杏的種子為實(shí)驗(yàn)材料。銀杏種子來源于地上自然脫落的果實(shí)，將采集的果實(shí)置于實(shí)驗(yàn)室，待果實(shí)在室溫下腐爛后去除種皮與果實(shí)，用自來水將種子清洗干凈后晾干，用濕沙攪拌均勻放置在通風(fēng)陰涼處，讓其自然層積。沙藏期間保持基質(zhì)的濕潤，并取出沙藏種子，用清水洗干凈，去除漂浮在水中的種子。選取沉在水底飽滿良好的種子，用高錳酸鉀溶液(1000 mg/L)消毒15 min，再用無菌蒸餾水沖洗5～6次。最后將處理的種子播種于裝有基質(zhì)的培養(yǎng)盆中，基質(zhì)的組分的體積比是草炭:蛭石:珍珠巖=1:1:1，基質(zhì)的pH值保持6.5。培養(yǎng)盆的長、寬、高的規(guī)格是650 mm×650 mm×750 mm。培養(yǎng)盆置于溫度為35℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)催芽，待銀杏種子長出白色嫩芽時(shí)，人工氣候箱晝夜溫度設(shè)為28℃/18℃，光照周期為18 h光照/6 h黑暗，空氣相對(duì)濕度為75%。待銀杏幼苗為四葉期時(shí)，分別進(jìn)行高鹽、干旱和高溫脅迫處理。非生物脅迫處理采取方法為：取健康生長的銀杏幼苗分別置于含有300 mmol/L的NaCl溶液模擬高鹽脅迫，20%的聚乙二醇(PEG6000)溶液模擬干旱脅迫，以及42℃人工氣候箱模擬高溫脅迫，以水作為脅迫處理的對(duì)照組。非生物脅迫各處理的時(shí)間分別為：0 h、6 h、24 h和48 h。每處理3次生物學(xué)重復(fù)，分別將同一脅迫處理時(shí)間采集的銀杏幼苗液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

TRNzol-A+總RNA提取試劑盒、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix Color SYBR Green熒光定量PCR試劑盒、瓊脂糖DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及限制性內(nèi)切酶購于北京天根公司；無縫克隆所需試劑、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pClone007-T Blunt Vector Kit載體、PCR擴(kuò)增高保真酶及引物合成購于北京擎科公司；2×CTAB緩沖液購于北京索萊寶公司；pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒、KpnI、XbaI高保真酶及GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞由武漢大智眾成科技有限公司提供。

1.3 RNA提取及cDNA合成

分別稱取新鮮銀杏幼苗根、莖、葉0.1 g，參考TRNzol-A+總RNA提取試劑盒說明提取總RNA，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?000 ng總RNA，按照FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，并置于-20℃冰箱保存待用。

1.4 GbASR基因克隆

在NCBI中通過查詢銀杏GbASR基因(登錄號(hào)：AY461715.1)，并獲得銀杏GbASR基因的全基因組、CDS及氨基酸序列。利用CTAB法提取銀杏幼苗葉片DNA，并以DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行克隆。本研究所用具體引物見表1，GbASR基因克隆及pCAMBIA1300-ASR-GFP融合表達(dá)載體構(gòu)建具體過程，參考駱鷹等[21]相關(guān)基因克隆操作步驟。

表1 本研究PCR擴(kuò)增所用引物信息

1.5 生物信息學(xué)分析

在對(duì)銀杏GbASR基因進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)時(shí)，利用Expasy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析；通過Expasy Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行蛋白親疏水性分析；通過NCBI中BLAST搜索其他物種的ASR同源蛋白，并利用DNAMAN進(jìn)行多重比對(duì)，最后通過MEGA7.0近鄰法(Neighbor joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 GbASR蛋白亞細(xì)胞定位

通過基因克隆方法獲得目的片段，利用KpnI和XbaI酶對(duì)質(zhì)粒pCAMBIA1300-GFP進(jìn)行酶切，并且把酶切產(chǎn)物與目的片段連接，從而構(gòu)建pCAMBIA1300-GbASR-GFP融合表達(dá)載體。將凍存的GV3101農(nóng)桿菌種復(fù)蘇，并制備好感受態(tài)細(xì)胞。將融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入GV3101感受態(tài)細(xì)胞，涂板，挑選陽性單克隆進(jìn)行菌落PCR。將陽性單克隆菌液送北京擎科公司測(cè)序，參考DNA質(zhì)粒抽提試劑盒(TIANGEN，Beijing)說明書從測(cè)序無誤的陽性單克隆菌液中提取質(zhì)粒。將含有pCAMBIA1300-GbASR-GFP融合表達(dá)載體的菌液進(jìn)行培養(yǎng)、然后進(jìn)行煙草侵染實(shí)驗(yàn)以及共聚焦顯微鏡觀察，具體過程參考謝旻等[22]有關(guān)亞細(xì)胞定位操作步驟。

1.7 GbASR基因表達(dá)分析

通過方法1.1樣品處理及采集和1.2 RNA提取及cDNA合成分別獲得銀杏幼苗根、莖、葉的總RNA和cDNA，用于GbASR基因表達(dá)分析。通過高鹽、干旱和高溫非生物脅迫處理，以抽提銀杏幼苗葉片總RNA和反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用qRT-PCR檢測(cè)逆境脅迫下GbASR表達(dá)量情況。qRT-PCR的總反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件、樣品處理及相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方法參考駱鷹等[21]相關(guān)基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)操作方法及步驟。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏葉片組織總RNA抽提及GbASR基因克隆

本研究對(duì)銀杏葉片組織總RNA進(jìn)行抽提，結(jié)果獲得比較完好的帶型（圖1A），該實(shí)驗(yàn)抽提的RNA比較完整，DNA和蛋白污染程度小，可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。利用CTAB法提取銀杏葉片組織DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)銀杏GbASR目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)DNA條帶是單一的，片段產(chǎn)物為546 bp，介于500～750 bp之間，這與本研究所設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的片段大小相符合（圖1B）。根據(jù)克隆相關(guān)步驟將目的片段與酶切后的線性載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板，挑選陽性單克隆進(jìn)行菌落PCR及電泳檢測(cè)(圖1C)，將陽性菌液送公司測(cè)序，從而獲得所需GbASR基因重組載體。

圖1 銀杏葉片組織總RNA提取及GbASR基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 GbASR蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

通過在線程序Expasy Protparam和Expasy Protscale分析銀杏GbASR蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GbASR蛋白的分子式為C861H1254N252O301S5，原子總數(shù)為2673個(gè)，分子量為20111.24Da，理論等電點(diǎn)(PI)為5.33，消光系數(shù)在280 nm時(shí)為22350；正電荷殘基(Arg+Lys)19個(gè)，負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)38個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為39.14，這表明該蛋白是酸性穩(wěn)定蛋白。蛋白脂肪參數(shù)為28.73，總平均親水性參數(shù)(GRAVY)為-1.390，推測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白。

2.3 GbASR同源蛋白序列及系統(tǒng)發(fā)生樹分析

通過GbASR蛋白氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST，下載GeneBank收錄的11個(gè)物種ASR蛋白氨基酸序列，通過DNAMAN軟件分析序列比對(duì)結(jié)果，并利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果表明，不同植物間ASR氨基酸序列相似性比較高，ASR蛋白在序列結(jié)構(gòu)上均含有1個(gè)高度保守ABA/WDS功能結(jié)構(gòu)域和2個(gè)組氨酸基序His-motif（圖2）。銀杏ASR蛋白(Ginkgo biloba AAR23420.1)的氨基酸序列與火炬松(Pinus taeda AAB03388.1)的相似性較高，為70.09%，在進(jìn)化樹中屬于同一個(gè)分支（圖3），這可能是因?yàn)樗鼈兺瑢儆诼阕又参?，其親緣關(guān)系較近。銀杏ASR蛋白與其他植物的相似性介于61.87%～81.01%之間，相似性差異范圍比較小，說明存在于不同植物中的ASR蛋白在長期進(jìn)化過程中能保持相對(duì)穩(wěn)定，表現(xiàn)出高度保守，因此，在不同物種中ASR蛋白呈現(xiàn)出多樣性。

圖2 GbASR蛋白與其他植物ASR蛋白序列比對(duì)

圖3 不同植物ASR蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 GbASR蛋白亞細(xì)胞定位分析

將克隆獲得的GbASR基因與酶切后的pCAMBIA1300-GFP載體連接，構(gòu)建pCAMBIA1300-GbASR-GFP融合表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將融合表達(dá)載體注入煙草葉片下表皮，在顯微鏡觀下察發(fā)現(xiàn)（圖4），轉(zhuǎn)入空載體pCAMBIA1300-GFP的對(duì)照組煙草葉片表皮細(xì)胞中均分布比較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)，而融合表達(dá)載體中的熒光信號(hào)只分布在煙草葉片表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中，這說明銀杏GbASR蛋白定位于細(xì)胞核，與GbASR作為轉(zhuǎn)錄因子的功能相符合。

圖4 GbASR蛋白亞細(xì)胞定位分析

2.5 GbASR基因的表達(dá)分析

為探究GbASR基因在銀杏幼苗根、莖、葉部的表達(dá)情況，以及響應(yīng)高鹽、干旱及高溫逆境脅迫的表達(dá)情況，本研究通過qRT-PCR檢測(cè)GbASR基因表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，GbASR基因在銀杏幼苗根、葉、莖部都有表達(dá)，且GbASR在葉部的表達(dá)水平相對(duì)較高，其次是莖部，而表達(dá)量最低是在根部（圖5A）。GbASR基因顯著受高鹽誘導(dǎo)，在鹽脅迫處理3 h時(shí)，其表達(dá)明顯增加，6 h時(shí)表達(dá)處于最低水平，然后呈上升趨勢(shì)，在24 h時(shí)其表達(dá)量最高（圖5B）。在干旱脅迫下，GbASR基因的表達(dá)呈先上升后下降，再上升的趨勢(shì)，在脅迫處理3 h時(shí)，其表達(dá)量最高（圖5C）。高溫脅迫下，GbASR基因的表達(dá)趨勢(shì)為先下降再逐步上升，當(dāng)12 h時(shí)達(dá)到最高，隨后下降，再上升的波動(dòng)趨勢(shì)（圖5D）。通過非生物脅迫實(shí)驗(yàn)可以推測(cè)，銀杏GbASR基因的表達(dá)顯著受鹽、干旱脅迫誘導(dǎo)，且在3 h時(shí)表達(dá)明顯增加。

圖5 GbASR基因組織特異表達(dá)及響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

ASR基因是植物中發(fā)現(xiàn)的一類主要參與果實(shí)成熟、應(yīng)答逆境脅迫的基因，當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)(如高鹽、干旱、高溫、低溫、滲透、ABA脅迫等)，ASR基因會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，從而降低或消除環(huán)境脅迫對(duì)植物細(xì)胞引起的傷害。因而，本研究對(duì)銀杏ASR基因進(jìn)行克隆、蛋白氨基酸序列及非生物脅迫下基因表達(dá)分析，這有利于闡明植物抵御不良環(huán)境的機(jī)理研究。

本研究利用無法克隆技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，從銀杏幼苗葉片中成功克隆ASR基因，該基因編碼區(qū)全長546 bp，編碼氨基酸的長度為182 aa；GbASR蛋白為親水性蛋白，其原因可能是由于該蛋白組成含有組氨酸等親水性氨基酸，這與糜子(Panicum miliaceum)、木薯(Manihot esculenta)中發(fā)現(xiàn)ASR蛋白的氨基酸組成相似[23-24]。通過與其他植物的ASR蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GbASR蛋白中含有1個(gè)高度保守ABA/WDS功能結(jié)構(gòu)域和2個(gè)組氨酸區(qū)域，說明銀杏GbASR蛋白具有其他植物ASR蛋白家族的典型特點(diǎn)。進(jìn)化關(guān)系分析表明銀杏GbASR蛋白與火炬松的ASR蛋白聚為一類，這驗(yàn)證了銀杏與火炬松同屬于裸子植物，具有較近的親緣關(guān)系。已有研究顯示，ASR蛋白主要分布于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，有的還分布于葉綠體中[25]，本研究銀杏GbASR蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，這與葡萄[25]、百合(Lilium longiflorum)花粉[25]、厚藤(Ipomoea pes-caprae)[26]ASR蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果一致，推測(cè)GbASR作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中發(fā)揮功能。

植物在應(yīng)答非生物脅迫(如高鹽、干旱、低溫等)、生長、發(fā)育等過程中通常會(huì)涉及ABA依賴/非依賴信號(hào)傳導(dǎo)途徑，而且利用滲透感受器感知周圍逆境脅迫信號(hào)，通過CDPKs、MAPK等信號(hào)途徑傳遞信息，最終引起相關(guān)基因表達(dá)[27]。據(jù)報(bào)道，ASR蛋白能夠增強(qiáng)植物的耐逆能力，主要體現(xiàn)在三個(gè)關(guān)鍵方面，一是植物ASR蛋白含有豐富的組氨酸成分，能夠與Fe3+或Cu2+等金屬離子結(jié)合，從而減少氧自由基產(chǎn)生，使游離于細(xì)胞中重金屬離子含量降低，減少對(duì)細(xì)胞的破壞[28]。二是植物ASR蛋白屬于無序蛋白，與植物中LEA蛋白具有相似的特征，可以在各種逆境脅迫環(huán)境下直接參與保護(hù)細(xì)胞，防止靶蛋白聚集，使蛋白質(zhì)活性不發(fā)送改變。三是植物ASR蛋白能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，如果與Zn2+結(jié)合，其蛋白構(gòu)象則發(fā)生變化，ASR蛋白的α螺旋和β折疊比例增加，形成二聚體，可以與DNA發(fā)生結(jié)合，發(fā)生轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[29]。本研究對(duì)銀杏GbASR基因進(jìn)行組織特異性表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)該基因在銀杏幼苗根、莖和葉中呈組成性表達(dá)，且在莖、葉中表達(dá)比在根中表達(dá)更強(qiáng)烈。通過鹽、干旱及高溫脅迫處理下的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下該基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)先上升后下降，再上升又下降的波動(dòng)趨勢(shì)，在脅迫24 h時(shí)，其表達(dá)量增加到對(duì)照(0 h)的4倍左右；干旱脅迫下，GbASR基因則呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)，在干旱脅迫3 h時(shí)，其表達(dá)量增加到對(duì)照(0 h)的4.5倍左右；高溫脅迫下，GbASR基因則呈現(xiàn)先下降后上升，再下降又上升的波動(dòng)趨勢(shì)。上述結(jié)果表明GbASR基因在高鹽、干旱及高溫脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)，該基因在抵御不良環(huán)境可能發(fā)揮重要調(diào)控功能，這與ASR基因在木薯中的功能報(bào)道相一致[28]。研究表明，水稻OsASR1蛋白能夠作為分子伴侶，具有清除活性氧的功能，從而增強(qiáng)水稻的抗逆性[30]。在酵母中過表達(dá)的厚藤IpASR不僅能夠增強(qiáng)對(duì)鹽脅迫的耐受性，還可以提高對(duì)氧化脅迫的耐受性[26]。

本研究利用無縫克隆技術(shù)對(duì)銀杏ASR基因進(jìn)行了克隆，并獲得ASR基因編碼區(qū)全長546 bp，共編碼182個(gè)氨基酸；通過亞細(xì)胞定位及生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)銀杏GbASR蛋白定位于細(xì)胞核，并為親水性穩(wěn)定蛋白；通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)GbASR基因在銀杏葉片部位相對(duì)表達(dá)量最高，且受高鹽、干旱及高溫脅迫誘導(dǎo)，這些逆境脅迫研究為進(jìn)一步明確銀杏ASR基因的功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為中草藥的育種、ASR基因抗逆分子機(jī)理等研究提供理論依據(jù)。