何沖 王彬 賈亦森 張利娟

摘 要：建立了同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中、飼料及尿液中17種β-受體激動(dòng)劑殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法（UPLC-MS/MS）。樣品經(jīng)粉碎后用試樣經(jīng)含2%甲酸水-乙腈-甲醇溶液勻漿提取，離心后，上清液經(jīng)凈化后，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，分別采用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，17種β-受體激動(dòng)劑在一定質(zhì)量濃度范圍1.0～10.0 μg/kg（腎上腺素為50～500 μg/kg）呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2>0.99;從1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和10.0 μg/kg（腎上腺素為50 μg/kg、100 μg/kg和500 μg/kg）3個(gè)添加濃度的檢測(cè)結(jié)果中可以看出，17種化合物的回收率為67%～110%。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC/MS-MS）;β-受體激動(dòng)劑;動(dòng)物源性食品;飼料

Determination of the β-agonist Residues by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

HE Chong， WANG Bin， JIA Yisen， ZHANG Lijuan

（Shanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Xi'an 710048，China）

Abstract：The method for the simulataneous determination of seventeen β-agonists residues in animal derived foods、feed and urine samples was developed by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC/MS-MS）.The sample was extracted in 2% formic acid/water-acetonitrile-methanol solution .The extraction was applied to a solid phase extraction cartridge for cleanup， determined by MRM， quantified by internal and external standard method.The calibration curves were goog liner between the peak arears and the concentrations of 1.0～10.0 μg/kg（The adrenaline 50～500 μg/kg） with the correlation coefficient R2>0.99.The average recoveries from spiked animal issues at three concentrations of 1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10.0 μg/kg （The adrenaline 50 μg/kg、100 μg/kg、500 μg/kg） ranged 67%～110%.

Keywords：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC/MS-MS）; β-agonists; animal derived food; feed

β-受體激動(dòng)劑類的使用可影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的流向，從而有效地促進(jìn)肌肉組織生長(zhǎng)，降低體內(nèi)脂肪含量，提高動(dòng)物瘦肉率[1]。競(jìng)技運(yùn)動(dòng)員食用可以增加肌肉/脂肪比并提高肌肉力量，同時(shí)還對(duì)呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)有興奮作用[2]。

目前，關(guān)于β-受體激動(dòng)劑類的檢測(cè)有HPLC法，GC/MS法、LC/MS法以及免疫法和毛細(xì)管電泳法等。液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS法）在20世紀(jì)80年代后迅速發(fā)展并逐漸成熟，在藥物分析、法醫(yī)學(xué)、商檢、環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用[3]?，F(xiàn)在，幾乎所有類的β-受體激動(dòng)劑都可以用LC-MS/MS法來(lái)檢測(cè)，但大部分檢測(cè)方法的前處理十分復(fù)雜，步驟煩瑣，目標(biāo)物回收率過(guò)低。同時(shí)不同基質(zhì)（如食品、飼料、尿液等）[4-6]無(wú)法同時(shí)處理，時(shí)間、試劑和耗材的消耗量過(guò)大使現(xiàn)有方法難以實(shí)現(xiàn)大批量樣品的快速檢測(cè)[7]。本文所研究的方法在滿足檢出限和回收率要求的前提下，簡(jiǎn)化了樣品前處理的步驟，并且該方法同時(shí)適用于食品、飼料和尿液的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液質(zhì)聯(lián)用儀，Thermo Fisher TSQ&Endura;電子天平，賽多利斯科學(xué)（北京）公司BSA224S;渦旋混勻器，Scientific Industries Vortex Genie 2T;冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司H2100R;全自動(dòng)SPE，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司EXTRA;氮吹儀，得泰儀器科技有限公司FV64。

1.2 試劑和耗材

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;所用水為超純水;Captiva EMR-Lipid凈化包（安捷倫）;Captiva RC針式過(guò)濾膜（安捷倫）;17種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及9種同位素內(nèi)標(biāo)信息詳見表4。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

用甲醇分別將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及同位素內(nèi)標(biāo)配制成濃度為10 μg/mL的儲(chǔ)備液（-18 ℃避光保存）。再分別精確吸取適量的儲(chǔ)備液配制成濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合內(nèi)標(biāo)溶液（腎上腺素除外）。加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液，用水稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.01 g）試樣置于50 mL具塞離心管中，加入混合同位素內(nèi)標(biāo)液，渦旋混勻。加入2 mL的2%甲酸水溶液和陶瓷均質(zhì)子高速勻漿2 min，再加入8 mL甲醇︰乙腈（6︰4）渦旋振蕩5 min，4 ℃低溫9 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液，加入到Captiva EMR-Lipid重力自流并收集（上樣后可以適當(dāng)增加壓力，保證流速在1滴/s左右，速度不要過(guò)快），待液體流干后加入2 mL的2%甲酸水︰乙腈（2︰8）洗脫，抽干，收集所有洗脫液。40 ℃氮吹至干，準(zhǔn)確加入1 mL水超聲復(fù)溶，過(guò)Captiva RC針式過(guò)濾膜，上機(jī)待分析。

1.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）或性能相當(dāng)者;流動(dòng)相：A為含0.1%甲酸水溶液，B為甲醇。流速：300 μL/min;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：5 μL，梯度洗脫程序見表 1。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）;檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）;噴霧電壓：3.5 kv（ESI+）;離子傳輸管溫度：350 ℃;霧化器溫度：300 ℃;鞘氣壓力：30 Arb;輔助器壓力：10 Arb;掃氣壓力：0 Arb。

1.6 定性與定量

在相同試驗(yàn)條件下測(cè)定試樣和濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，記錄試樣和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的色譜保留時(shí)間，以相對(duì)于最強(qiáng)離子豐度的百分比作為定性離子的相對(duì)離子豐度。若試樣中檢出與標(biāo)準(zhǔn)溶液中興奮劑保留時(shí)間一致的色譜峰，且其定性離子與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度相比，偏差不超過(guò)表2規(guī)定的范圍，可以確定試樣中檢出相應(yīng)的目標(biāo)物。

根據(jù)試樣中目標(biāo)物的含量情況，選取濃度相近的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析。混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)液中目標(biāo)物的響應(yīng)值均在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi)。以色譜峰面積按內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法分別定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 17種β-受體激動(dòng)劑及內(nèi)標(biāo)總離子流圖譜

圖1為17種β-受體激動(dòng)劑以及其相對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖譜，從圖中可以看出目標(biāo)物在該色譜條件下分離度較好、質(zhì)譜響應(yīng)值完全滿足信噪比要求，液相和質(zhì)譜條件均能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 線性關(guān)系

17 種 β- 受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

分別在樣品中添加17種興奮劑檢出限、定量限和10倍檢出限濃度的目標(biāo)物進(jìn)行樣品的回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法在1～10 ?g/kg（腎上腺素50～500 ?g/kg）添加濃度范圍內(nèi)，回收率為67%～110%。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的20%。

3 結(jié)論

與目前國(guó)內(nèi)通用方法相比，本研究在滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢出限、穩(wěn)定性和精密度要求的前提下極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，縮短了樣品前處理的時(shí)間。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物源性食品、飼料和尿液等不同基質(zhì)中17種β-受體激動(dòng)劑殘留量都進(jìn)行了檢測(cè)研究，結(jié)果表明該方法還具有廣泛的應(yīng)用性。解決了現(xiàn)有方法中不同基質(zhì)需要采用不同前處理方法的問題。

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