孫玉榮 胡冬梅 劉靜 楊文志 王玉玨 江云鵬

摘 要：目的：探究水解時(shí)間對(duì)乳與乳制品中糠氨酸含量測(cè)定的影響。方法：在75 ℃、30 min及75 ℃、15 s殺菌條件下測(cè)定不同水解時(shí)間下乳與乳制品中的糠氨酸含量，探究其重復(fù)性與穩(wěn)定性。結(jié)果：在75 ℃、30 min條件下，隨著水解時(shí)間的增加，乳與乳制品中糠氨酸含量有所增加。當(dāng)水解時(shí)間為9.0 h，乳與乳制品中的糠氨酸含量達(dá)到最高，之后緩慢降低。乳與乳制品中的糠氨酸含量的加標(biāo)回收率均>90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<6%。結(jié)論：不同水解時(shí)間會(huì)影響到乳與乳制品中的糠氨酸含量。

關(guān)鍵詞：糖氨酸;水解時(shí)間;檢測(cè)方法

Effect of Different Hydrolysis Time on Determination of Furosine Content in Milk and Dairy Products

SUN Yurong， HU Dongmei*， LIU Jing， YANG Wenzhi， WANG Yujue， JIANG Yunpeng

（Mengniu Dairy （Chabei） Co.， Ltd.， Chabei Administrative District Zhangbei County， Hebei Province， Zhangjiakou 076481， China）

Abstract： Objective： To explore the effect of hydrolysis time on the determination of furosine content in milk and dairy products. Method： Determine the content of furosine in milk and dairy products under the conditions of?75 ℃， 30 min and 75 ℃， 15 s under different hydrolysis time， and explore its repeatability and stability. Results： Under the condition of 75 ℃ and 30 min， with the increase of hydrolysis time， the content of furosine in milk and dairy products increased. When the hydrolysis time was 9.0 h， the content of furosine in milk and dairy products reached the highest， and then slowly decreased. The recovery rates of the addition of furosine content in milk and dairy products were both >90%， and the relative standard deviation was <6%. Conclusion： Different hydrolysis time will affect the content of furosine in milk and dairy products.

Keywords： glycine; hydrolysis time; detection method

糠氨酸是牛乳在加熱過程中，氨基酸、蛋白質(zhì)與乳糖通過美拉德反應(yīng)生成ε-N-脫氧乳果糖基-L-賴氨酸（ε-N-deoxylactolusy-L-lysine），經(jīng)酸水解轉(zhuǎn)換成更穩(wěn)定的糠氨酸（ε-N-2-furoylmethyl-L-lysine，ε-N-2-呋喃甲基-L-賴氨酸）[1]。這個(gè)反應(yīng)的大小程度與生乳在滅菌過程中熱處理的類型與強(qiáng)度有著密切的聯(lián)系，與成品液態(tài)奶品質(zhì)的優(yōu)良息息相關(guān)。

《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》（NY/T 939—2016）中糠氨酸含量的測(cè)定：試樣經(jīng)鹽酸水解后測(cè)定蛋白質(zhì)含量，水解液經(jīng)稀釋后用高效液相色譜（HPLC）或超高效液相色譜（UPLC）在紫外（波長(zhǎng)280 nm）檢測(cè)器下進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量[2]?；谒鈺r(shí)間要求（110±2）℃下加熱水解12～23 h。

因耗時(shí)較長(zhǎng)的原因，本文分析研究水解1～13 h的糠氨酸的回收率，并進(jìn)行回收率試驗(yàn)，對(duì)比分析1～13 h的糠氨酸檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

甲醇（CH3OH）：色譜純;濃鹽酸（HCL，密度為1.19 g/mL）;三氟乙酸：色譜純;乙酸銨;糠氨酸（C12H17N2O4·XHCL）;水相濾膜;水相針頭式濾器;1 mL注射器。

1.2 儀器

配有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀;（110±2）℃干燥箱;密封耐熱試管：容積為20 mL;電子天平：感量為0.1 mg;凱氏定氮儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 采樣

用于檢測(cè)的巴氏殺菌乳在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中的溫度為2～6 ℃，UHT滅菌乳儲(chǔ)存和運(yùn)輸溫度不高于25 ℃。按《隨機(jī)數(shù)的產(chǎn)生及其在產(chǎn)品質(zhì)量抽樣檢驗(yàn)中的應(yīng)用程序》（GB/T 10111—2008）的規(guī)定取不少于250 mL樣品，樣品在送檢過程中應(yīng)完好無損且樣品儲(chǔ)存環(huán)境條件符合要求。

1.3.2 試樣水解液的制備

吸取2.00 mL試樣，置于密閉耐熱試管中，加入6.00 mL 10.6 mol/L鹽酸溶液，混勻。密閉試管，置于干燥箱中，在110 ℃下加熱水解1～13 h，加熱約1 h后，輕輕搖動(dòng)試管。在加熱結(jié)束后，將試管從干燥箱中取出，冷卻后用濾紙過濾，濾液供測(cè)定[2]。

1.3.3 試樣水解液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

移取2.00 mL試樣水解液，按《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5—2016）的規(guī)定測(cè)定試樣溶液中的蛋白質(zhì)含量[3]。

1.3.4 糠氨酸含量的測(cè)定原理

試樣經(jīng)鹽酸水解后測(cè)定蛋白質(zhì)含量，水解液經(jīng)稀釋后用高效液相色譜（HPLC）或超高效液相色譜（UPLC）在紫外（波長(zhǎng)280 nm）檢測(cè)器下進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。

1.3.5 試樣水解液中糠氨酸含量測(cè)定

移取1.00 mL試樣水解液，加入5.00 mL的6 g/L乙酸銨溶液，混勻，過0.22 μm水相濾膜，濾液供上機(jī)測(cè)定。

1.3.6 HPLC測(cè)定

（1）色譜參考條件。色譜柱：CAPCELL PAK C18 TYPE：AQ 250 mm×4.6 mm，5 μm粒徑;柱溫：32 ℃;流動(dòng)相：0.1%三氟乙酸溶液為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B;洗脫梯度，見表1。

（2）糠氨酸含量測(cè)定。利用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的混合液（50∶50）以1 mL/min的流速平衡色譜系統(tǒng)。然后，用初始流動(dòng)相平衡系統(tǒng)直至基線平穩(wěn)。空白試劑為10 ?L鹽酸溶液（濃度3 mol/L），選擇10 μL待測(cè)溶液對(duì)糠氨酸含量進(jìn)行測(cè)量。

（3）蛋白質(zhì)含量的計(jì)算。

蛋白質(zhì)含量的計(jì)算，如式（1）所示：

（1）

其中：X-試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100 g;V1-試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL;V2-試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL;C-硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L;

0.014 0-1.0 mL硫酸[c（?H2SO4）=1.000 mol/L]或鹽酸

[c（HCl）=1.000 mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g;m-試樣的質(zhì)量，g;V3-吸取消化液的體積，

mL;F-氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，各種食品中氮轉(zhuǎn)換系數(shù);100-換算系數(shù)。

（4）糠氨酸含量的計(jì)算。糠氨酸含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)F計(jì)，數(shù)值以毫克每百克蛋白質(zhì)（mg/100 g蛋白質(zhì)）表示，糠氨酸含量的計(jì)算如（2）所示：

（2）

其中：At-測(cè)試樣品中糠氨酸峰面積的數(shù)值;Astd-糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中糠氨酸峰面積的數(shù)值;Cstd-糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/L;D-測(cè)定時(shí)稀釋倍數(shù)，（D=6）;m-樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度，g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中糖氨酸含量F（mg/100 g蛋白質(zhì)）

標(biāo)樣的濃度為2 mg/L，以標(biāo)樣的峰面積為儀器采集數(shù)據(jù)，對(duì)樣品中糖氨酸的含量F進(jìn)行計(jì)算。樣品在乳糖酶作用下，牛乳水解1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h和13 h，采用HPLC法對(duì)牛乳中糠氨酸含量進(jìn)行測(cè)量。作為MailIard反應(yīng)產(chǎn)生的特定產(chǎn)物，糠氨酸近年來常常被用于食品受熱程度的判斷與評(píng)估，主要應(yīng)用在谷物、蛋類、肉制品及中藥口服液中。由表2可知，隨著乳糖酶水解時(shí)間的延長(zhǎng)，乳與乳制品中糠氨酸含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。經(jīng)過75 ℃、30 min及75 ℃、15 s預(yù)殺菌處理?xiàng)l件下，可以發(fā)現(xiàn)其前者較后者所獲得的糠氨酸含量成倍升高。按照《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》要求，其中的糠氨酸含量>12 mg/100 g蛋白質(zhì)或UHT乳中糠氨酸含量>190 mg/100 g 蛋白質(zhì)，表示含有復(fù)原乳。當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到9 h后，乳與乳制品中糠氨酸含量>190 mg/100 g蛋白質(zhì)，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，糠氨酸含量逐漸降低。乳與乳制品經(jīng)過75 ℃、15 s熱處理，糠氨酸含量較低，相當(dāng)于有復(fù)原乳的巴氏殺菌乳。

2.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在已知糠氨酸含量供試驗(yàn)品中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)樣品，反復(fù)進(jìn)行5次測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，其回收率均在90%以上。按照公式計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果為：

3 結(jié)論

本文對(duì)《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》分析步驟中的試樣水解液的制備[3-4]，水解時(shí)間在9 h的糠氨酸含量回收率進(jìn)行分析論證得到，樣品的回收率結(jié)果符合回收率要求90%～110%（高效液相色譜法測(cè)定復(fù)原乳中糠氨酸的含量回收率試驗(yàn)）[5]，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.68，符合獨(dú)立測(cè)試結(jié)果<10%的要求。隨著乳糖水解時(shí)間的延長(zhǎng)，乳與乳制品中糠氨酸含量呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，當(dāng)水解時(shí)間為9 h且經(jīng)過75 ℃、30 min熱處理，糠氨酸含量>190 mg/100 g蛋白質(zhì)，乳與乳制品相當(dāng)于含有復(fù)原乳的UHT殺菌乳，在75 ℃、15 s條件下，乳與乳制品獲得糠氨酸含量少，僅為含有復(fù)原乳的巴氏殺菌乳。按照《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》制備試樣水解液，將水解時(shí)間控制為9 h，獲得的糠氨酸含量最高，且具有較高的回收率，標(biāo)準(zhǔn)偏差<10，故可應(yīng)用于實(shí)際的檢測(cè)工作中，節(jié)約人工成本、提高工作效率。

參考文獻(xiàn)

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