王平，劉洋，黃偉，劉傳炯

(1.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，成都610081；2.畫稿溪國家級自然保護區(qū)管理處，四川瀘州646405)

2020年4月，在四川瀘州畫稿溪國家級自然保護區(qū)內(nèi)海拔660 m的溪流附近，采集到4號(標(biāo)本號:HGX2020022～HGX2020025)角蟾科Megophryidae標(biāo)本(圖1)，周圍環(huán)境為苦竹Pleioblastusamarus與落葉闊葉混交林，微生境為流水崖壁下、石下以及有流水的草本植物叢中。結(jié)合分子系統(tǒng)發(fā)育重建及形態(tài)比較，確定該4號標(biāo)本為角蟾科掌突蟾屬Leptobrachella的畢節(jié)掌突蟾Leptobrachellabijie，系四川省兩棲類新記錄種。

1 方法

根據(jù)費梁和葉昌媛(2001)的測量方法，對4號標(biāo)本進行了測量與記錄，其他物種的形態(tài)數(shù)據(jù)來自Wang等(2019)。

將其中2號標(biāo)本利用OMEGA試劑盒提取DNA，利用引物L(fēng)3957/H4551(Simonetal.，1994)擴增16SrDNA基因序列。擴增體系為25 μL，95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min，10 ℃結(jié)束。擴增產(chǎn)物送蘇州金唯智公司測序，利用LaserGene.v7.1(DNASTAR Inc.，美國)及MEGA 7(Kumaretal.，2016)對獲得的序列進行處理。基于測序獲得的序列片段、在NCBI上下載的部分掌突蟾屬物種以及外群東方鋤足蟾Pelobatessyriacus、摩洛哥鋤足蟾Pelobatesvaraldii序列，利用MrBayes 3.2.2(Ronquistetal.，2012)，最佳進化模型為GTR+I+G，由Partitionfinder 2.1.1基于Akaike Information Criterion (AIC)計算所得，及RaxmlGUI 1.5(Silvestro &Michalak，2012)，模型為GTRGAMMA，bootstrap設(shè)為1 000，其他參數(shù)保持默認，分別重建所采集標(biāo)本的貝葉斯法和最大似然法系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹。同時利用MEGA 7計算物種及種群間的遺傳距離，使用模型為Kimura 2-parameter，其他參數(shù)保持默認。

2 結(jié)果

4號標(biāo)本體長為30.5～33.6 mm；背部棕褐色，具小疣粒；體側(cè)具稀疏的不規(guī)則黑斑點；腿及前臂背面具3～4條褐色橫紋；前后肢腹面紫黑色，具較密集的不規(guī)則灰白色斑點；腹部白色，具淡灰色斑點；腋腺白色；指間無蹼，趾間微蹼。

獲得2條16SrDNA堿基序列，長度為564 bp。重建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹和最大似然樹一致顯示，該4號標(biāo)本與畢節(jié)掌突蟾的模式標(biāo)本聚為一支(圖2)，并享有0.7%的遺傳距離。

3 討論

結(jié)合形態(tài)比較及分子系統(tǒng)發(fā)育研究，本次采自畫稿溪國家級自然保護區(qū)的4號標(biāo)本均為畢節(jié)掌突蟾，為四川省兩棲類新記錄。

掌突蟾屬具有非常高的潛在物種多樣性，近幾年，我國學(xué)者至少描述了該屬17個新種(中國兩棲類，2020)。另一方面，掌突蟾屬物種形態(tài)保守性非常高，使得僅靠形態(tài)比較進行分類研究往往導(dǎo)致誤鑒定，不同的物種常常被鑒定為同一物種，并認為其廣泛分布。利用綜合的研究手段對掌突蟾屬物種進行分類與分布研究應(yīng)該提上日程。

致謝：本工作得到了畫稿溪國家級自然保護區(qū)的支持，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)陳重光在野外工作中的幫助，宜賓學(xué)院郭鵬教授在分子實驗上的幫助，在此一并致謝！