唐興奎，林玉坤，何嘉琳，羅喜俊，梁俊杰，朱顯軍

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球范圍內(nèi)影響人類(lèi)健康與生活質(zhì)量的常見(jiàn)惡性胃腸道腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)直腸癌占所有惡性腫瘤死亡原因的第5位［1］。目前，結(jié)直腸癌的根治性治療方法迄今仍首推外科手術(shù)治療，然而其5年生存率僅為50%左右［2］。全身放化療是中晚期結(jié)直腸癌腫瘤患者手術(shù)前新輔助和術(shù)后治療的標(biāo)準(zhǔn)有效的方法之一，但藥物不良反應(yīng)大并且容易產(chǎn)生耐藥而導(dǎo)致治療效果差甚至失?。?］。腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是治療失敗的關(guān)鍵原因，因此，分析結(jié)直腸癌的生物學(xué)特性，探索其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要的臨床價(jià)值。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞往往需要攝取大量的能量以維持其快速增殖代謝特性，而肌酸激酶（Creatine kinase，CK）則是細(xì)胞能量代謝中的關(guān)鍵酶，可逆地催化磷酸基團(tuán)從三磷酸腺苷向肌酸的轉(zhuǎn)移。目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)了五種不同的亞型的CK，包括在細(xì)胞質(zhì)中有的CKB（腦型），CKM（肌肉型）和CKMB（混合型），以及線粒體中普遍存在的線粒體肌酸激酶（uMtCK）和線粒體肌酸激酶（sMtCK）［4?6］。uMtCK作為細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的中央控制器，可與許多細(xì)胞中的胞質(zhì)CK共表達(dá)，特別是在腦，胎盤(pán)，腎臟，睪丸，精子和內(nèi)皮細(xì)胞等高能量需求的組織中［4，5］。既往研究發(fā)現(xiàn)：uMtCK在肺癌、胃癌、前列腺癌及乳腺癌等腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，并且與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移能力息息相關(guān)［6-12］。然而，目前尚缺少u(mài)MtCK對(duì)結(jié)直腸癌生物學(xué)作用影響的報(bào)道，本文將探究uMtCK在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)特點(diǎn)，并研究其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響及潛在機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選取2017年01月至2019年12月期間在我院行結(jié)直腸癌根治性手術(shù)的患者60例，收集其新鮮癌組織和配對(duì)癌旁組織標(biāo)本以及臨床資料。

1.2 主要試劑和儀器

RNAiso Plus（9180）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR036）、熒光定量PCR試劑盒（RR820）購(gòu)自日本Takara公司，細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清及Matrigel膠均購(gòu)自美國(guó)Corning公司，CCK?8細(xì)胞增殖試劑盒（KGA317）、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（KGA512）購(gòu)自上海凱基公司，PI3K、AKT、p?AKT、mTOR、p?mTOR、GAPDH兔抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)RNAiso Plus提取組織或細(xì)胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行目的基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件設(shè)置：預(yù)變性95℃30 s，共40個(gè)循環(huán)（95℃5 s，65℃30 s，95℃5 s）。引物序列由上海生工公司合成：uMtCK引物上游：5′?CTACTCCAGGATCCCGTAGC?3′，uMtCK引物下游5′?TCGGAGGTCTGGGTACTCAG?3′；GAPDH引物上游：5′?CTCCTCACAGTTGCCATGTA?3′，下游5′?GTTGAGCACAGGGTACTTTATTG?3′。采用2?ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平，內(nèi)參為GAPDH。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞（FHC）以及結(jié)直腸癌細(xì)胞（HT?29、SW620、LoVo、HCT116、RKO、SW480）置于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，均使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于6孔板（5×105/孔），按照Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染處理，實(shí)驗(yàn)分組為si?NC、si?uMtCK?1和si?uMtCK?2。

1.3.3 CCK?8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用CCK?8法進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。收集轉(zhuǎn)染24 h后的結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于96孔板（1000/孔），分別接種后24 h、48 h、72 h加入10μL CCK?8試劑，避光孵育2 h，450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)采用Transwell法分別檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲。收集轉(zhuǎn)染48 h后的結(jié)直腸癌細(xì)胞，以不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按2×105/100μL接種于Transwell培養(yǎng)板上室（侵襲實(shí)驗(yàn)所用上室經(jīng)10% Matrigel膠預(yù)包被處理），下室加入500μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫溶液染色，顯微鏡下選取隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.3.5 Western blot實(shí)驗(yàn)收集轉(zhuǎn)染48 h后的結(jié)直腸癌細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS?PAGE電泳，接著電轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別進(jìn)行5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原，PI3K（1∶1000）、AKT（1∶1000）、p?AKT（1∶1000）、mTOR（1∶1000）、p?mTOR及GAPDH（1∶5 000）等一抗孵育過(guò)夜，次日孵育HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000），ECL試劑發(fā)光顯色后進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPadPrism 7.0軟件。計(jì)數(shù)資料比較則采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料中兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD?t檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan?Meier法，組間比較采用log?rank檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 uMtCK高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后有關(guān)

為了驗(yàn)證uMtCK高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征和生存時(shí)間的相關(guān)性，我們收集了上述臨床病例的病理特征資料和隨訪資料，并分析uMtCK表達(dá)量與臨床病理特征和生存時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果表明：uMtCK在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)現(xiàn)象（圖1A）；Kaplan?Meier生存分析顯示，高表達(dá)uMtCK的患者無(wú)瘤生存時(shí)間較低表達(dá)者明顯縮短（圖1 B）；uMtCK高表達(dá)與T分期、N分期和TNM分期密切相關(guān)（表1）。以上結(jié)果表明，uMtCK高表達(dá)可能影響腫瘤進(jìn)展，并提示患者的不良預(yù)后。

表1 uMtCK表達(dá)水平與結(jié)直腸患者臨床病理特征的相關(guān)性（n）

圖1 uMtCK高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后A：uMtCK在

2.2 uMtCK在結(jié)直腸癌細(xì)胞株表達(dá)升高

熒光定量PCR檢測(cè)5株結(jié)直腸癌細(xì)胞（HT?29、SW620、LoVo、HCT116、RKO、SW480）內(nèi)uMtCK的表達(dá)，以人正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞（FHC）作為對(duì)照組。結(jié)果顯示，uMtCK在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)均高于人正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞（圖2A，P＜0.001）；選擇表達(dá)水平較高HT?29和RKO細(xì)胞構(gòu)建uMtCK低表達(dá)細(xì)胞模型，熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA后HT?29和RKO細(xì)胞內(nèi)LINC00239表達(dá)顯著受到抑制（圖2B，P＜0.001），提示模型構(gòu)建成功。

圖2 uMtCK在人結(jié)直腸癌細(xì)胞、正常結(jié)直腸粘膜細(xì)胞A：及siRNA轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細(xì)胞；B：中的表達(dá)情況，***P＜0.001

2.3 敲低uMtCK表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力

為了探究uMtCK對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖特性的影響，我們利用uMtCK低表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行了CCK?8增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，si?uMtCK?1和si?uMtCK?2組細(xì)胞的增殖能力較siNC組明顯減弱（圖3，P＜0.001）。說(shuō)明敲低uMtCK表達(dá)抑制細(xì)胞增殖能力。

圖3 敲低uMtCK表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響A：HT?29細(xì)胞；B：RKO細(xì)胞；***P＜0.001

2.4 敲低uMtCK表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及侵襲能力

為了探究uMtCK對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，我們通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，si?uMtCK?1和si?uMtCK?2組細(xì)胞遷徙數(shù)量和侵襲數(shù)量均較siNC組顯著減少（圖4，P＜0.001）。說(shuō)明敲低uMtCK表達(dá)抑制細(xì)胞遷移及侵襲能力。

圖4 敲低uMtCK表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響A：HT?29細(xì)胞；B：RKO細(xì)胞；***P＜0.001

2.5 敲低uMtCK表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活性

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為了驗(yàn)證uMtCK和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活性的相關(guān)性，我們利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，si?uMtCK?1和si?uMtCK?2組細(xì)胞內(nèi)PI3K、p?AKT、p?mTOR蛋白表達(dá)量較siNC組明顯下調(diào)。說(shuō)明敲低uMtCK表達(dá)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活性（圖5）。

圖5 敲低uMtCK表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活性的影響A：HT?29細(xì)胞；B：RKO細(xì)胞；***P＜0.001

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生是由于促癌基因被激活和/或抑癌基因下調(diào)/失活所誘發(fā)，近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織和正常組織中不同基因表達(dá)量存在顯著差異，提示其在腫瘤演進(jìn)過(guò)程中起著重要作用，既可能是促癌基因的推動(dòng)腫瘤演進(jìn)的重要因素，又可能對(duì)腫瘤演進(jìn)起到抑制作用［13］。同樣地，部分特異基因可通過(guò)各種機(jī)制的表達(dá)失調(diào)參與結(jié)直腸癌的演進(jìn)，與腫瘤演進(jìn)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望成為具有結(jié)直腸癌診斷、治療及預(yù)測(cè)預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物［14］。本研究首次發(fā)現(xiàn)uMtCK高表達(dá)于結(jié)直腸癌組織，其表達(dá)量與患者的腫瘤分期存在緊密聯(lián)系，高表達(dá)uMtCK提示患者無(wú)瘤生存率降低。因此，我們認(rèn)為uMtCK是結(jié)直腸癌潛在的促癌基因，有望成為新型的腫瘤標(biāo)志物和預(yù)后判斷指標(biāo)。

分子蛋白可在結(jié)直腸癌組織中構(gòu)建復(fù)雜而又精密的調(diào)控體系，其表達(dá)失調(diào)能夠引起結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)的各種生物學(xué)變化，在不同層次精細(xì)的調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移［15］。已有研究顯示，uMtCK高表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤的增殖或轉(zhuǎn)移能力［6-12］。本研究也發(fā)現(xiàn)uMtCK能夠調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖特性，敲低uMtCK表達(dá)能夠降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力，提示靶向抑制uMtCK表達(dá)可以發(fā)揮抗腫瘤作用。腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲是惡性腫瘤的關(guān)鍵特征，是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的直接因素［16］。本研究揭示uMtCK是結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的重要調(diào)控因子，敲低uMtCK表達(dá)可以同時(shí)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷徙及侵襲能力。

研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［17］。PI3K是PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白之一，它廣泛存在于各類(lèi)腫瘤細(xì)胞，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為［18］。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路傳導(dǎo)鏈上另一個(gè)關(guān)鍵性調(diào)節(jié)蛋白是Akt，它是PI3K最重要的下游底物，當(dāng)PI3K被誘導(dǎo)激活后，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜將迅速產(chǎn)生PIP3蛋白，PIP3蛋白充當(dāng)?shù)诙攀梗湍[瘤細(xì)胞內(nèi)與生長(zhǎng)因子受體后，進(jìn)一步促進(jìn)Akt蛋白磷酸化，最后使后者活化［17］?；罨疉kt再通過(guò)蛋白磷酸化作用激活其下游靶蛋白mTOR，最終對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、周期及轉(zhuǎn)移等惡性行為發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［19］。本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)uMtCK低表達(dá)細(xì)胞模型中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低uMtCK能夠下調(diào)PI3K蛋白及Akt磷酸化、mTOR磷酸化蛋白的表達(dá)，提示PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活性受到抑制。由此可見(jiàn)，uMtCK在結(jié)直腸癌細(xì)胞中介導(dǎo)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，這可能是uMtCK調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷徙及侵襲的分子調(diào)控機(jī)制之一，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次證實(shí)uMtCK高表達(dá)于結(jié)直腸癌，其高表達(dá)與患者的腫瘤分期及臨床預(yù)后有關(guān)。更重要的是，本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明uMtCK能夠調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，并揭示uMtCK與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路異常激活密切相關(guān)?？偟膩?lái)說(shuō)，本研究提示了uMtCK可能成為結(jié)直腸癌預(yù)后及靶向治療的潛在腫瘤標(biāo)志物。