曹億，彭吉才，鐘廣正，朱頡*

醫(yī)用膠水越來(lái)越多地替代創(chuàng)傷或手術(shù)后傷口/切口的縫合術(shù)，這種關(guān)閉創(chuàng)面、止血和密封傷口的作用甚至可產(chǎn)生更好的傷口護(hù)理和美容效果［1，2］。由于醫(yī)用膠水易于使用，節(jié)省手術(shù)時(shí)間，促使研究和開(kāi)發(fā)更具生物相容性、更低的細(xì)胞毒性、更好的組織彈性的高濕粘合強(qiáng)度醫(yī)用膠水［3］，各種天然生物聚合物如纖維蛋白、膠原蛋白、明膠、白蛋白、殼聚糖用于制備醫(yī)用膠，這些生物聚合物具有化學(xué)和生理相互作用比如凝血過(guò)程［4］，并已用于神經(jīng)外科、骨科、牙周、眼科、心血管、氣胸、胃腸、整形和重建手術(shù)［2］。由于醫(yī)用膠水中存在的不同官能團(tuán)的相互作用、化學(xué)相互作用涉及到聚合物的潤(rùn)濕和溶脹、聚合物鏈和粘膜之間的相互作用，加之臨床實(shí)踐上常見(jiàn)到的使用醫(yī)用膠后創(chuàng)面迅速愈合現(xiàn)象，作者認(rèn)為醫(yī)用膠水不但能夠縮小創(chuàng)口或創(chuàng)面，還可能與創(chuàng)面組織相互作用促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。本文通過(guò)建立小鼠撕脫傷急性創(chuàng)面模型，研究醫(yī)用膠涂抹創(chuàng)面是否影響組織愈合。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型的建立

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料SPF級(jí)健康雄性C57小鼠18只，質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2016?0029。動(dòng)物在中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境、溫度、濕度、光照按照SPF級(jí)飼養(yǎng)條件實(shí)施。實(shí)驗(yàn)方案符合《赫爾辛基宣言》的原則。醫(yī)用膠水為α?氰基丙烯酸正丁酯醫(yī)用粘合劑，由廣東龍心醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)，許可證號(hào)：20010379。

1.1.2 造模、分組、傷口護(hù)理將小鼠用乙醚吸入進(jìn)行麻醉，剃去背部毛發(fā)，75%乙醇消毒，在小鼠背部正中標(biāo)記1個(gè)面積約3 cm2的長(zhǎng)方形區(qū)域，用無(wú)菌手術(shù)刀沿長(zhǎng)方形標(biāo)記切除皮膚，創(chuàng)面深達(dá)真皮，未及筋膜層，大體觀察可見(jiàn)創(chuàng)面表皮完全缺失，真皮部分缺失，創(chuàng)面呈鮮紅色，后用碘伏消毒。隨機(jī)分為三組（每組6只小鼠）：①醫(yī)用膠組：創(chuàng)面涂以醫(yī)用膠水，干燥后用紗布覆蓋包扎；②凡士林組：創(chuàng)面用凡士林覆蓋后，紗布包扎；③對(duì)照組：直接用紗布包扎固定。以上三組每2天換藥一次。

1.1.3 組織的獲取各組分別于修復(fù)第0、2、6、10天進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，第10天進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，評(píng)估皮膚創(chuàng)面修復(fù)效果。麻醉動(dòng)物后，準(zhǔn)備手術(shù)。用生理鹽水清除傷口表面的滲液后，在創(chuàng)面中心用手術(shù)刀取活檢組織并存儲(chǔ)在無(wú)菌離心管，4℃保存。定量分析評(píng)價(jià)，第0、2、6、10天免疫印跡（Western blotting）、酶聯(lián)免疫（ELISA）。組織病理學(xué)進(jìn)行免疫組化、免疫熒光評(píng)價(jià)，第10天安樂(lè)死動(dòng)物后，在動(dòng)物豎脊肌處取一大小約1 cm×0.5 cm×1 cm組織，固定在10%甲醛中并于4℃儲(chǔ)存，直到切片和染色。

1.2 測(cè)定指標(biāo)

1.2.1 計(jì)算創(chuàng)面愈合率 采集每組小鼠的創(chuàng)面圖像，用ImageJ軟件計(jì)算創(chuàng)面面積，得出創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積?未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.2.2 免疫印跡（Western blotting）檢測(cè)炎癥介質(zhì)IL?6、TNF?α表達(dá)炎癥介質(zhì)IL?6、TNF?α在傷口組織的表達(dá)是通過(guò)免疫印跡評(píng)估的。提取組織總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS?PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，滴加一抗（鼠標(biāo)抗體），4℃過(guò)夜，TBST洗滌5 min×3次，加入二抗（羊抗兔），室溫孵育1 h，洗膜，ECL試劑顯影成像。用ImageJ軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定IL?6和TNF?αIL?6和TNF?α表達(dá)量按照ELISA試劑盒試驗(yàn)方法測(cè)定。

1.2.4 免疫組織化學(xué)分析IL?6、TNF?α表達(dá)情況

取全層創(chuàng)面組織及少許周圍正常組織，40 g/L多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透臘、包埋、切片。進(jìn)行蘇木精?伊紅染色，觀察創(chuàng)面治療后的表皮、真皮、皮下組織細(xì)胞、纖維增生情況。采用相應(yīng)IL?6、TNF?α的一抗及二抗，了解IL?6、TNF?α表達(dá)量的情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用（±s）表示，三組間均數(shù)比較，用單因素方差分析（One?way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni法，方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面愈合率

隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，三組小鼠創(chuàng)面面積都在逐漸縮小。如圖1所示，第6天開(kāi)始，醫(yī)用膠組和對(duì)照組脫痂現(xiàn)象較明顯；第10天醫(yī)用膠組創(chuàng)面接近完全愈合，其次為對(duì)照組，凡士林組愈合較慢。統(tǒng)計(jì)分析第2、6、10天三組創(chuàng)面愈合情況見(jiàn)表1、表2，醫(yī)用膠組分別與凡士林組、對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)小鼠大體創(chuàng)面愈合情況

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組創(chuàng)面面積情況比較（cm2，x±s，n=6）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組平均創(chuàng)面愈合率（%）

2.2 免疫印跡（Western blotting）檢測(cè)IL?6、TNF?α的表達(dá)情況

免疫印跡結(jié)果如圖2所示，第0、2、6、10天測(cè)得三組IL?6、TNF?α的表達(dá)情況，同一組內(nèi)的表達(dá)量呈先增高后降低的趨勢(shì)；不同組間同一時(shí)間點(diǎn)比較，醫(yī)用膠組表達(dá)最少，其次為對(duì)照組，凡士林組表達(dá)最多。醫(yī)用膠組與凡士林組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（IL?6組第2、6天P＜0.05；TNF?α組第2、6、10天P＜0.05）。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)免疫印跡檢測(cè)IL?6、TNF?α表達(dá)情況

2.3 ELISA檢測(cè)IL?6和TNF?α的表達(dá)情況

ELISA結(jié)果如圖3所示，第2、6、10天酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測(cè)炎癥介質(zhì)IL?6、TNF?α表達(dá)量，同一組內(nèi)的表達(dá)量呈先增高后降低的趨勢(shì)；不同組間同一時(shí)間點(diǎn)比較，醫(yī)用膠組表達(dá)最少，其次為對(duì)照組，凡士林組表達(dá)最多。醫(yī)用膠組分別與凡士林組、對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)ELISA檢測(cè)IL?6和TNF?α表達(dá)情況

2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)IL?6、TNF?α的表達(dá)情況

第10天免疫組化、HE染色結(jié)果如圖4所示，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)膠水組少于凡士林組及對(duì)照組；IL?6、TNF?α表達(dá)量，膠水組表達(dá)最少，其次為對(duì)照組，凡士林組表達(dá)最多。

圖4 第10天免疫組化檢測(cè)IL?6、TNF?α的表達(dá)情況（HE染色，×200）

3 討論

醫(yī)用膠是一種用來(lái)粘合傷口的成熟的化學(xué)制劑。我國(guó)1962年起開(kāi)始研究和生產(chǎn)醫(yī)用膠粘劑，迄今為止，主要品種有α?氰基丙烯酸乙酯、丁酯、異丁酯等，用作替代外科手術(shù)縫合及組織粘合［5］。與傳統(tǒng)縫合術(shù)相比，它具有操作簡(jiǎn)單、術(shù)后傷口疤痕小、方便護(hù)理等優(yōu)勢(shì)，在臨床創(chuàng)面的應(yīng)用范圍越來(lái)越廣泛，因而受到重視。本實(shí)驗(yàn)選用的膠水成分是α?氰基丙烯酸正丁酯，為軟組織膠粘劑，主要通過(guò)初級(jí)化學(xué)鍵粘合方式與底物粘合［2］。它還具有可以在體內(nèi)分解、排泄等特點(diǎn)，可用于皮膚切口粘合、食管和腸管再吻合粘接、血管的粘接、缺損組織的修補(bǔ)、瘺孔的封閉、滲出液的封閉，以及臟器手術(shù)中的止血等［6-8］。

急性創(chuàng)面的愈合過(guò)程是一個(gè)連續(xù)的復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。一般包括三個(gè)階段，即炎癥期、增生期和重塑期。炎癥期：此期開(kāi)始于受傷后第1～4天，纖維蛋白凝塊形成。血小板是第一個(gè)動(dòng)員到創(chuàng)面的細(xì)胞，這些細(xì)胞釋放血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）。在炎癥期，主要參與的是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，伴低水平的蛋白酶。這些化學(xué)介質(zhì)幫助分解細(xì)胞外基質(zhì)以便于新基質(zhì)的形成。增生期：此期發(fā)生于受傷后第4～21天，成纖維細(xì)胞起主要作用。此期主要是血管生成、上皮形成和肉芽形成的時(shí)期。重塑期：在重塑期，膠原進(jìn)入到創(chuàng)面內(nèi)，增強(qiáng)張力。膠原交聯(lián)和纖維增加，在前兩個(gè)階段生成的大量細(xì)胞進(jìn)入到程序性細(xì)胞死亡和凋亡的過(guò)程中。本實(shí)驗(yàn)從小鼠大體創(chuàng)面的修復(fù)面積速度上以及免疫組化HE染色上可以看出，醫(yī)用膠組修復(fù)較其他組快，且炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較其它組少，局部無(wú)不良并發(fā)癥。應(yīng)用膠水在處理創(chuàng)面上具有安全性和有效性。

IL?6和TNF?α被認(rèn)為是參與皮膚再生的關(guān)鍵促炎因子，大量的促炎可以擴(kuò)大和延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)［9，10］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫印跡、ELISA及免疫組化等方法，從定量和定性方面分析IL?6和TNF?α表達(dá)情況。結(jié)果證實(shí)醫(yī)用膠組創(chuàng)面炎癥介質(zhì)的各指標(biāo)表達(dá)量少，創(chuàng)面修復(fù)快，可以加快創(chuàng)面的修復(fù)。此外，第10天組織標(biāo)本免疫組化圖片仍可看到各組較多IL?6和TNF?α表達(dá)量，考慮第10天小鼠創(chuàng)面仍處于增生期、未完全愈合以及近創(chuàng)面?zhèn)谌〔脑蛞?。此外分析凡士林組炎性介質(zhì)表達(dá)量高于對(duì)照組，可能原因?yàn)榉彩苛旨啿加托晕镔|(zhì)影響傷口炎性反應(yīng)速度、轉(zhuǎn)歸，略慢于空白對(duì)照組。但凡士林紗布具有一定的防粘連、止血的作用，值得在對(duì)癥傷口的護(hù)理上應(yīng)用和肯定。

總之，醫(yī)用膠水建立了細(xì)菌進(jìn)入傷口的物理屏障，它的促進(jìn)傷口愈合的效果也可能與減少傷口感染有關(guān)［11］。除了在普通皮膚軟組織裂傷的傷口應(yīng)用外，在急性撕脫創(chuàng)面?zhèn)诘挠仙希簿哂幸欢ǖ臏p少炎性介質(zhì)、促進(jìn)修復(fù)及愈合作用，且具有良好的安全性和有效性，具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討研究。