危文波

(省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，西藏 拉薩 850032)

大麥屬于禾本科大麥屬，具有麩皮的為皮大麥，沒(méi)有的是裸大麥。當(dāng)前，大麥育種研究的主要目標(biāo)是培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、抗逆性好的大麥品種，而隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法可以幫助育種工作者快速達(dá)成這一目標(biāo)。

1 大麥遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法和電擊轉(zhuǎn)化法等大麥遺傳轉(zhuǎn)化的常用的方法中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法理論和機(jī)理相對(duì)清晰，其中根癌農(nóng)桿菌是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中運(yùn)用最多的。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是將外源基因通過(guò)農(nóng)桿菌侵染導(dǎo)入大麥中，并使外源基因穩(wěn)定表達(dá)遺傳的方法。而且在基因轉(zhuǎn)化的研究得到迅速發(fā)展之后，再生獲得的大麥植株占遺傳轉(zhuǎn)化獲得的植株的80%[1]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有轉(zhuǎn)基因沉默少、拷貝數(shù)量低、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，這都是基因槍法不具備的[2]。不同大麥基因型[3]、受體的選擇[4]、培養(yǎng)基配方[5]、共培養(yǎng)過(guò)程[6]等因素都會(huì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥遺傳轉(zhuǎn)化。目前，大麥品種“Golden Promise”相比較于其它品種的再生能力更強(qiáng)，也作為大麥遺傳轉(zhuǎn)化的主要受體。為誘導(dǎo)幼胚的愈傷組織發(fā)生及其持續(xù)生長(zhǎng)，在FHG基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加Dicamba比2，4-D更加明顯[5]。早在1997年，Tingay等[3]將大麥品種“Golden Promise”的幼胚作為受體，以農(nóng)桿菌作為載體，將外源Bar基因和gus基因轉(zhuǎn)入，并收獲轉(zhuǎn)化成功的大麥植株54個(gè)，但其轉(zhuǎn)化成功率僅有4.2%。

1.1 農(nóng)桿菌菌株

當(dāng)前農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化普遍效率較低，是因?yàn)榫昊盍r(shí)常發(fā)生變化，影響侵染的有效性；也是由于不同類(lèi)型植株對(duì)農(nóng)桿菌菌株的侵染能力有較大的差異，因而在實(shí)際的操作過(guò)程中應(yīng)當(dāng)篩選最敏感或最合適的農(nóng)桿菌菌株[7]。Kazuhito等[8]在1992年報(bào)道了應(yīng)用LBA4404轉(zhuǎn)化成功的例子，并表現(xiàn)出比EHA105更高的轉(zhuǎn)化效率，雖然高毒性農(nóng)桿菌AGL1要超出LBA4404的轉(zhuǎn)化效率2～3倍，但是該農(nóng)桿菌的過(guò)量生長(zhǎng)很大程度地影響了侵染后植株的再生。

1.2 菌液濃度和侵染時(shí)間

菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的影響很大，菌液濃度過(guò)低，附著于外植體愈傷組織切口處的農(nóng)桿菌量不夠，轉(zhuǎn)化效率降低；菌液濃度過(guò)高，外植體誘導(dǎo)的愈傷組織會(huì)褐變致死，很難得到抗性愈傷組織。對(duì)大多數(shù)植物受體來(lái)說(shuō)，侵染效率最高的菌液濃度OD600值是在0.2～0.6范圍內(nèi)[9]。除菌液濃度外，菌液侵染外植體的時(shí)長(zhǎng)也會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化的結(jié)果產(chǎn)生影響。附著于外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織切口的農(nóng)桿菌數(shù)量會(huì)隨著侵染外植體時(shí)長(zhǎng)的增加而增加，侵染時(shí)間過(guò)短，農(nóng)桿菌菌液數(shù)量過(guò)少，不足于侵染愈傷組織；侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌液長(zhǎng)時(shí)間浸泡造成傷害。兩種情況都不利于外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化，因此篩選合適的侵染時(shí)間會(huì)直接影響到大麥的遺傳轉(zhuǎn)化效率[10]。

1.3 共培養(yǎng)時(shí)間

研究表明，在附著外植體后農(nóng)桿菌并不立即轉(zhuǎn)化，而是在經(jīng)過(guò)約16h的“細(xì)胞調(diào)節(jié)期”之后才會(huì)發(fā)生T-DNA的轉(zhuǎn)移[2]。通過(guò)Shrawat等[6]的研究表明，農(nóng)桿菌侵染大麥后條件20～25℃溫度環(huán)境下共培養(yǎng)2～3d，可使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最佳?？梢?jiàn)，轉(zhuǎn)化效率是受到共培養(yǎng)時(shí)間的影響，而且不同植株的外植體，相同農(nóng)桿菌的最佳共培養(yǎng)時(shí)間也是不同的。

2 應(yīng)用

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化功能基因?yàn)榇篼溒焚|(zhì)的改良提供了技術(shù)支撐，其中包括大麥的抗逆性特別是非生物脅迫耐受性、籽粒產(chǎn)量以及大麥的麥芽和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等。

2.1 非生物脅迫耐性

在植株的生長(zhǎng)過(guò)程中，外界不同程度的光、溫、水、氣等氣候條件和營(yíng)養(yǎng)條件都會(huì)產(chǎn)生有利或不利的影響，而植株本身就含有可以減少或降低非生物脅迫的基因。如何有效地發(fā)現(xiàn)并利用這些功能基因，改善大麥植株的進(jìn)化周期和適應(yīng)過(guò)程，也是農(nóng)作物育種者的努力方向。

2.1.1 金屬離子耐受性

小麥品種“Triticumaestivum”對(duì)高濃度鋁離子的耐受性特別強(qiáng)，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，是ALMT1的基因在發(fā)揮作用。Delhaize等[11]在大麥品種“Golden Promise”中轉(zhuǎn)入該基因，其轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)出類(lèi)似小麥品種的基因表達(dá)量且穩(wěn)定，在鋁離子較高的水培和酸性很強(qiáng)的土壤中均表現(xiàn)良好。

2.1.2 抗旱性與抗寒性

小麥的2個(gè)CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子持續(xù)過(guò)量表達(dá)也控制多種脅迫應(yīng)答基因的活性。Morran等[12]將小麥的TaDREB2和TaDREB3 2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入大麥植株內(nèi)，轉(zhuǎn)化植株體內(nèi)外源基因的持續(xù)過(guò)量表達(dá)減緩了其生長(zhǎng)發(fā)育，影響其受粉，導(dǎo)致產(chǎn)量下降；但是在嚴(yán)重缺水情況下，TaDREB2和TaDREB3的轉(zhuǎn)化植株比非轉(zhuǎn)化植株的對(duì)照的生存狀態(tài)更好。定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，提高轉(zhuǎn)化大麥植株中TaDREB2和TaDREB3表達(dá)量，可以增加CBF/DREB基因以及LEA/COR/DHN的表達(dá)，從而有效改善轉(zhuǎn)化植株的抗旱性和抗寒性。

2.2 籽粒產(chǎn)量

細(xì)胞激動(dòng)素是一種植物激素，其在各個(gè)組織器官中的活性受到細(xì)胞激動(dòng)素脫氫酶(CKX)的調(diào)節(jié)。Zalewski等[13]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含HvCKX1部分編碼基因的干涉載體轉(zhuǎn)入大麥品種“Golden Promise”，以RNAi的方式降低了CKX1的表達(dá)。與野生型比較，轉(zhuǎn)基因大麥T0株系根部CKX1活性明顯降低，產(chǎn)生的種子數(shù)量和千粒重顯著增加，提高了作物的產(chǎn)量，為通過(guò)基因水平調(diào)控CKX達(dá)到增產(chǎn)目的提供了潛在的可能性。

2.3 麥芽品質(zhì)

啤酒釀造的基礎(chǔ)材料是麥芽，如何利用外源功能基因去改良麥芽的品質(zhì)一直是啤酒大麥育種工作者的追求。在大麥啤酒的釀造過(guò)程中，如何有效控制影響釀造效率的因素，包括有可發(fā)酵糖類(lèi)的數(shù)量、麥芽汁粘的稠度和過(guò)濾狀況、細(xì)胞壁和淀粉的水解的淀粉酶和葡聚糖酶的數(shù)量等都影響著麥芽的品質(zhì)。劉雷[14]等2005年向大麥幼胚中導(dǎo)入TrxS基因，獲得了T0代轉(zhuǎn)基因植株49株,PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，目的基因已成功轉(zhuǎn)入，T2代轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)結(jié)果表明，該大麥植株基因組完整遺傳TrxS基因。通過(guò)測(cè)定發(fā)芽種子中淀粉酶的活性發(fā)現(xiàn)，對(duì)比野生型植株，轉(zhuǎn)基因植株的α-淀粉酶活力高出0.63倍，β-淀粉酶活力則高出11.1ug·min-1。

2.4 營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)

大麥在土壤中吸收到的鋅元素的數(shù)量影響其最終的產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，而鋅元素運(yùn)輸載體AtZIP1基因影響著鋅元素的攝取速度。Ramesh等[15]以大麥品種Golden Promise為受體，利用農(nóng)桿菌將擬南芥中該外源功能基因轉(zhuǎn)入其中，并使其過(guò)量表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同條件下的土壤中，遺傳轉(zhuǎn)化的大麥植株籽粒不管是鋅元素、鎂元素以及鐵元素的總含量，還是每粒種子中的平均含量均比正常大麥中的含量更高。微量元素的含量一定程度上影響著作物的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，而調(diào)控?cái)z取微量元素的機(jī)制，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為其提供了途徑和方法。

盡管大麥遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展迅猛，特別是青稞全基因組測(cè)序的完成和轉(zhuǎn)化品種的不斷擴(kuò)大，但還是有很多問(wèn)題限制其發(fā)展，包括轉(zhuǎn)化完成后不同大麥品種的再生體系不盡相同，轉(zhuǎn)化植株體內(nèi)外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性和組織特異性，以及要考慮和研究遺傳轉(zhuǎn)化大麥的環(huán)境與生物安全性等[16]。在解決了這些限制因素后，相信在功能基因的挖掘、生理機(jī)制等基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究和食品以及育種等生產(chǎn)領(lǐng)域的研究，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化有著更加亮眼的未來(lái)。