張國(guó)武，孟慶玲*，喬 軍，王熙鳳，張 凱，寧程程，季春輝，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 新疆 石河子 832003； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】片形吸蟲病(Fascioliasis)是由肝片吸蟲(Fasciolahepatica，F(xiàn)h)、大片吸蟲(Fasciolagigantica，F(xiàn)g)及“中間型”吸蟲引起的一種重要的螺源性人獸共患寄生蟲病，該病在全球具有廣泛的流行性，多為散發(fā)流行，在我國(guó)呈地方性流行[1]。動(dòng)物和人類常因生食帶有囊蚴的水生植物或飲用被囊蚴污染的水而感染該病，成蟲常寄生于牛、羊、鹿等反芻動(dòng)物及其它多種草食性哺乳動(dòng)物和人的肝臟膽管內(nèi)，可引起急性、亞急性及慢性肝片吸蟲病，給家畜生產(chǎn)和人類健康帶來(lái)嚴(yán)重危害。近年來(lái)，隨著氣候的變化，全球牲畜吸蟲病的流行率和疾病發(fā)生率不斷加劇[2]。據(jù)WHO報(bào)告，全世界超過(guò)75個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)告了片吸蟲病的感染病例[3]，其中51個(gè)國(guó)家有人群感染了肝片吸蟲[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界至少有260萬(wàn)～1700萬(wàn)人感染片形吸蟲病，超過(guò)1.8億人和2.5億～7億生產(chǎn)動(dòng)物面臨感染風(fēng)險(xiǎn)[5-7]，該病可導(dǎo)致牛羊產(chǎn)奶量、肉類產(chǎn)量降低甚至造成其發(fā)病死亡，嚴(yán)重威脅全球糧食安全，每年給全球帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)30億美元[8]。Fh中間宿主——淡水貝類在我國(guó)許多放牧地區(qū)廣泛分布，導(dǎo)致人畜肝片吸蟲病的流行，嚴(yán)重危害牧民健康，制約畜牧業(yè)的發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前對(duì)該病的防治主要依賴于三氯苯達(dá)唑等抗寄生蟲藥物[9]，但由于三氯苯達(dá)唑等驅(qū)蟲藥物長(zhǎng)期大劑量使用，F(xiàn)h對(duì)驅(qū)蟲藥抗性不斷增加[10]，導(dǎo)致驅(qū)蟲效率降低，肝片吸蟲病的發(fā)病和流行呈上升趨勢(shì)。此外，由于肝片吸蟲生活史復(fù)雜，中間宿主和終末宿主廣泛，且Fh被膜蛋白(Tegumental antigens,FhTeg)[11]、排泄分泌產(chǎn)物(Excretion/secretion products,ESP)[12]及細(xì)胞外囊泡(Extracellular vehicles,EVs)[13-14]等成分復(fù)雜多樣，免疫調(diào)控機(jī)制尚不清楚，導(dǎo)致目前尚未研發(fā)出特異性高、敏感性強(qiáng)的診斷方法和高效的新型疫苗，給該病的診斷和防控帶來(lái)了極大的困難?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】篩選出反應(yīng)原性強(qiáng)、特異性強(qiáng)的抗原蛋白，研發(fā)特異敏感的診斷方法及安全高效的新型疫苗對(duì)該病的科學(xué)防控具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為了研發(fā)特異性強(qiáng)、敏感性高的肝片吸蟲病免疫學(xué)診斷方法，本研究對(duì)肝片吸蟲Legumain基因進(jìn)行克隆和分子特征分析，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Fh抗原蛋白，篩選并制備具有強(qiáng)反應(yīng)原性Fh診斷抗原分子，為放牧動(dòng)物肝片吸蟲病的科學(xué)防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

表達(dá)載體pET-32a(+)和大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存。Transetta(DE3)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)、限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和XhoI、DNA Marker、pMD19-T(simple)克隆載體、T4DNA Ligase、IPTG、蛋白Marker均購(gòu)自TaKaRa公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒(D2500-2)購(gòu)自O(shè)mega公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。Gold View核酸染料購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG、NC膜均購(gòu)自康為世紀(jì)生物公司，增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已公布的肝片吸蟲(登錄號(hào)：LN628878.1)全基因組序列，利用 Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)Legumain基因的上、下游特異性引物F1和R2，并參考pET-32a(+)表達(dá)載體的特性，分別在引物上、下游5′端引入BamH I和XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，F(xiàn)1(上游)：5′ CGCGGATCCATGTTATCCATGCAAATTTTA 3′(下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn))；R2(下游)：5′ CCGCTCGAGTCAAACACAAACATCATGAAT 3′(下劃線部分為XhoⅠ 酶切位點(diǎn))，引物由華大基因生物公司合成。

1.3 Fh Legumain基因的擴(kuò)增、克隆及測(cè)序

將采集的新鮮Fh蟲體用 PBS 緩沖液清洗4～5遍，剪蟲體的 1/5(約 10 mg)，按照Trizol法提取Fh總RNA。用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物F1-R2進(jìn)行Legumain基因的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：H2O 9 μL，PCR Mixture 8 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL。RT-PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，切膠后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，將目的片段克隆入與pMD19-T載體中，將重組載體送至華大基因生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 Fh Legumain基因及其編碼蛋白的分子特征分析

將測(cè)序得到的序列與NCBI上GenBank中已公布的Legumain基因的序列進(jìn)行BLAST同源比對(duì)分析，并利用ProtParam、TMHMM、Signal P、Motif Scan、DNA Star、IEDB、BepiPred-2.0和Expasy(Http://www.expasy.org)等軟件分析預(yù)測(cè)Legumain蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、結(jié)構(gòu)域、潛在的糖基化位點(diǎn)、優(yōu)勢(shì)抗原表位、結(jié)構(gòu)域；通過(guò)SOMPA和Swiss-model預(yù)測(cè)目的蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 Fh Legumain基因的遺傳進(jìn)化分析

應(yīng)用DNAMAN、MEGA 6.0等軟件對(duì)GenBank中已公布的大片吸蟲、日本血吸蟲、華支睪吸蟲、馬來(lái)絲蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲等寄生蟲Legumain基因的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，并采用NJ法(Neighbor-joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展值(bootstrap value)重復(fù)次數(shù)為1000。

1.6 Fh Legumain基因的表達(dá)與鑒定

將膠回收目的片段和原核表達(dá)載體pET-32a(+)連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-Leg。將重組質(zhì)粒pET-Leg轉(zhuǎn)化入Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，加入1.0 mmol/ L IPTG(終濃度)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白是否表達(dá)。收集重組菌菌體，用超聲波破碎，提取重組蛋白，并進(jìn)行蛋白純化。純化后蛋白置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Fh Legumain蛋白的抗原特性分析

將濃縮后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析后，以感染Fh的綿羊陽(yáng)性血清(1∶1000稀釋)為一抗，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG(1∶3000稀釋)為二抗，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，分析其反應(yīng)原性。取10只雌性小鼠( 7只為實(shí)驗(yàn)組，3只為對(duì)照組。將純化后的重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑乳化混勻后，實(shí)驗(yàn)組的每只小鼠皮下注射200 μL，間隔14 d后進(jìn)行第2次免疫。二免和三免時(shí)(間隔7 d)，將純化后重組蛋白與等體積弗氏不完全佐劑乳化混勻，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠皮下注射200 μL，三免14 d后心臟采血，靜置分離血清。用羊肝片吸蟲IgG抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)免疫小鼠血清是否產(chǎn)生抗體，分析其免疫原性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fh Legumain基因的RT-PCR擴(kuò)增及雙酶切鑒定

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小約1278 bp的目的條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致，證明成功克隆到了Legumain基因(圖1)。將克隆成功的Legumain基因轉(zhuǎn)化入EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性菌株，提質(zhì)粒后經(jīng)BamH I、XhoI 雙酶切，得到1條約2693 bp的載體片段和1條約1278 bp的插入片段，表明pMD19-T克隆載體中成功插入目的片段(圖2)。

M：標(biāo)準(zhǔn)DNA(DL2000)；1～3：Legumain基因RT-PCR產(chǎn)物 M:DNA marker (DL2000); 1-3: RT-PCR product of Legumain gene圖1 Fh Legumain基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplifications of Fh Legumain gene

2.2 Fh Legumain基因測(cè)序結(jié)果及分子特征分析

Legumain基因cDNA全長(zhǎng)1278 bp，編碼425個(gè)氨基酸。該序列與GenBank中公布的Fh(BN1106_s1861B000097)Legumain基因的核苷酸序列同源性為99.45%，氨基酸序列同源性為99.76%。該蛋白無(wú)跨膜區(qū)，在1～21位有信號(hào)肽。DNAStar分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白抗原表位區(qū)集中在第19～28、73～103、205～216、254～308、319～337、360～375、394～413位。SMART和Motif Scan軟件分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于半胱氨酸蛋白酶C13家族，有1個(gè)保守的peptidase C13結(jié)構(gòu)域(27～284)、1個(gè)凝血因子V LSPD重復(fù)區(qū)(LSPR,239～247)；2個(gè)酰胺化位點(diǎn)(124～127、273～276)；2個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn)(155～160、314～319)；3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(210～213、261～264、285～288)；4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(24～26、286～288、291～293、400～402)；8個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)表明該蛋白的活性受到磷酸化的調(diào)控。SOMPA軟件預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋(h)占45.65%，β轉(zhuǎn)角(t)占4.71%；無(wú)規(guī)則卷曲(c)占33.18%，表明Legumain蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。三級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)卷曲連接9個(gè)α-螺旋和10個(gè)β轉(zhuǎn)角構(gòu)成“Z”字形的空間結(jié)構(gòu)(圖3)。

2.3 Fh Legumain基因的同源性與遺傳進(jìn)化分析

FhLegumain與GenBank中肝片吸蟲(BN1106_s1861B000097)、(JXXN02000574.1)及大片吸蟲(EF206822.1)氨基酸序列的同源性較高，分別為99.45%、99.30%、95.62%，位于同一進(jìn)化分枝上，表明親緣關(guān)系較近；但與華支睪吸蟲、日本血吸蟲、馬來(lái)絲蟲及其他寄生蟲同源性在33.33%～53.44%，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表現(xiàn)出較大的種屬差異(圖4)。

M：標(biāo)準(zhǔn)DNA(DL5000)；1：重組質(zhì)粒pMD-Leg4/5；2～3：重組質(zhì)粒pMD-Leg4/5雙酶切產(chǎn)物 M: DNA marker (DL5000); 1: pMD-Leg4/5 plasmid; 2-3: Products of pMD-Leg4/5 plasmid digested by double enzyme圖2 重組質(zhì)粒pMD-Leg4/5雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD-Leg4/5 by double enzyme digestion

Legumain基因引物序列(下劃線)；抗原表位集中區(qū)(陰影部分)；1個(gè)Peptidase_C13結(jié)構(gòu)域(虛線框)；1個(gè)凝血因子V LSPD重復(fù)(LSPR)(斜體)；2個(gè)酰胺化位點(diǎn)(虛下劃線)；2個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)(雙下劃線)；3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(波浪線)；4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(方框)；8個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(斜體加粗) Primer sequence of Legumain gene (underlined);The antigen epitope clusters (shaded);One Peptidase_C13 structure domain (dotted box);one Coagulation Factor V LSPD Repeat (Italics);Two amidation sites (virtual underline);Two N-myristoylation sites (double underlined);Three N-glycosylation sites (wavy lines);Four protein kinase C phosphorylation sites (box);Eight Casein kinase II phosphorylation sites (Italic bold)圖3 Legumain基因核苷酸序列及編碼氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence and amino acid sequence of Legumain

圖4 基于Legumain基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on nucleotide sequence of Legumain gene

2.4 重組表達(dá)載體的鑒定

重組表達(dá)載體pET-Leg4/5經(jīng)EcoRⅠ和XhoI 雙酶切，得到5900 bp的載體片段和1278 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖5)。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明成功將目的基因插入到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中。

2.5 Fh Legumain重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

SDS-PAGE檢測(cè)到65 kDa處有單一目的條帶，與預(yù)測(cè)大小一致；而在超聲裂解上清中未見目的條帶，表明重組蛋白以包涵體形式存在。純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)可見單一的蛋白條帶，透析后濃縮至終濃度為1 mg/mL，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖6-A)。

2.6 重組蛋白的反應(yīng)原性與免疫原性分析

以綿羊Fh陽(yáng)性血清為一抗，以HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG為二抗，經(jīng)western blot分析可見單一的蛋白條帶(圖6-B)，證明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性。重組蛋白免疫小鼠后獲得的血清用羊Fh IgG抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組10只小鼠血清均為陽(yáng)性，對(duì)照組5只均為陰性，表明Fh 重組蛋白Legumain能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，具有較強(qiáng)的免疫原性。

M：標(biāo)準(zhǔn)DNA(DL5000)；1～2：重組質(zhì)粒pET-Leg4/5雙酶切產(chǎn)物；3：重組質(zhì)粒pET-Leg4/5 M: DNA marker (DL5000); 1-2: Products of pET-Leg4/5 plasmid digested by double enzymes; 3: pET-Leg45 plasmid圖5 重組質(zhì)粒pET-Leg4/5雙酶切鑒定Fig.5 Identification of recombinant plasmid pET-Leg4/5 by double enzyme digestion

3 討 論

肝片吸蟲病的早期準(zhǔn)確診斷對(duì)于該病的科學(xué)防控至關(guān)重要。目前，肝片吸蟲病的診斷主要依賴于病原學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)診斷方法。然而，F(xiàn)h在侵染終末宿主2～3個(gè)月后才能成熟排卵，排卵初期蟲卵數(shù)量較少[15]，且排卵數(shù)受感染階段[16]、感染負(fù)荷和驅(qū)蟲藥物的影響，因此通過(guò)糞便中蟲卵檢查的可靠性低、敏感性差[17]，難以了解其實(shí)際感染情況。因此，糞便中蟲卵檢測(cè)方法不適合該病早期、急性期及潛伏期的診斷。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從Fh的被膜蛋白、排泄分泌產(chǎn)物(ESP)及細(xì)胞外囊泡(EVs)等成分中篩選出組織蛋白酶(L1，L2，L5)、組織蛋白酶B、過(guò)氧化物酶(Prx)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)以及Fh防御分子(Fh HDM))等[18-19]多個(gè)Fh抗原蛋白并進(jìn)行了免疫學(xué)特性研究。然而，由于Fh抗原成分非常復(fù)雜，國(guó)內(nèi)外已建立的Fh診斷方法其特異性和敏感性不夠理想，且與其他寄生蟲存在一定的血清交叉反應(yīng)，在一定程度上限制了其在Fh流行地區(qū)的推廣使用。因此，開展Fh蛋白抗原特性研究對(duì)于研發(fā)肝片吸蟲病敏感、特異的診斷抗原具有重要意義。

Legumain屬于肽酶C13家族，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(Asparaginyl endopeptidase,AEP)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。該蛋白是大片吸蟲、肝片吸蟲[20]、血吸蟲、華支睪吸蟲[21]和泰國(guó)肝吸蟲[22]等寄生蟲排泄分泌產(chǎn)物(ESP)的重要成分，可在其多個(gè)發(fā)育階段特異性表達(dá)[23]。因此，Legumain在吸蟲病的診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Laha等[22]利用重組Ov-AEP-1抗原對(duì)后睪吸蟲病的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其敏感性和特異性分別為85%和100%，顯示出較好的診斷抗原潛力。在曼氏血吸蟲中，基于天冬酰胺內(nèi)肽酶(Sm32)建立的檢測(cè)抗體的ELISA具有較高的敏感性和特異性[24]，提示Sm32重組抗原是診斷埃及流行地區(qū)血吸蟲病的重要候選抗原之一[25]。

圖A: 重組蛋白Legumain 4/5的SDS-PAGE鑒定。M.蛋白marker；1.pET-32a載體菌株IPTG誘導(dǎo)6 h；2.重組菌誘導(dǎo)前；3～6.重組菌誘導(dǎo)2、4、6、8 h；7～8.純化后的Legumain4/5重組蛋白。圖B：重組蛋白Legumain 4/5的western blot分析。M.蛋白marker；1.重組蛋白上清液；2.重組蛋白 A: Identification of recombinant Legumain 4/5 by SDS-PAGE.M.Protein marker; 1.pET-32a carrier strains IPTG induction of 6 hours; 2.Before the recombinant strains induct; 3-6.Recombinant strains induced by 2, 4, 6, 8 hours; 7-8.Legumain 4/5 recombinant protein after purification.B:Western blotting analysis of recombinant Legumain 4/5.M. Protein marker; 1.Supernatant of recombinant protein; 2.Recombinant protein圖6 重組蛋白Legumain 4/5的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定結(jié)果Fig.6 Induced expression and identification of recombinant protein Legumain 4/5

4 結(jié) 論

本研究對(duì)FhLegumain蛋白基因的分子特征及其免疫學(xué)特性進(jìn)行了研究，通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增出綿羊FhLegumain基因，測(cè)序后對(duì)該基因進(jìn)行了分子特征分析，并高效表達(dá)該重組蛋白。Western blot分析證實(shí)，該重組蛋白可被綿羊肝片吸蟲陽(yáng)性血清特異性識(shí)別；小鼠免疫試驗(yàn)證實(shí)該蛋白具有良好的免疫原性，提示該蛋白在肝片吸蟲免疫學(xué)診斷方法研發(fā)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。