劉家源，劉文科

(中國農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，農業(yè)農村部設施農業(yè)節(jié)能與廢棄物處理重點實驗室，北京 100081)

引言

氮素供應水平影響植株生長發(fā)育具有一定的濃度效應，氮素供應不足和過量均會抑制植株生長發(fā)育，氮素水平的高低會影響植物體內AsA的含量。研究表明，氮素營養(yǎng)對植物體內AsA含量沒有影響或者使其增加，但是過量的氮會降低植物體內AsA的含量[1]。張玉彬等[2]研究發(fā)現，生長光強一致時，水培生菜的AsA等物質的含量隨營養(yǎng)液氮水平的升高而增加。在作物生長過程中，協(xié)調好氮營養(yǎng)和光環(huán)境條件可以發(fā)揮兩者對作物產量及品質提升的最佳耦合效應，進而實現作物優(yōu)質高產[3]。

抗壞血酸(Ascorbic Acid, AsA)，又稱維生素C，是一種抗氧化劑，與其他抗氧化劑共同組成抗氧化系統(tǒng)，保護植物免受有氧代謝、光合作用和多種污染物造成的氧化損害[4]。AsA參與了一些植物激素如乙烯、赤霉素等物質合成代謝過程。內源性 AsA水平的高低會影響植物開花衰老相關的誘導，與開花時間、細胞的凋亡、病原體的信號轉導和植物體衰老的發(fā)展都有聯系[5]。光照是對AsA積累至關重要的環(huán)境因子[6]。AsA在葉片中的總濃度與光照有關。已有大量研究表明，在一定光強范圍內，光強越大植物體內的AsA含量越高[7]。AsA循環(huán)再生過程中，APX、DHAR、MDHAR和GR作為抗氧化酶隨著光照強度的增加而增加，從而提高AsA的含量以及植物在高光強下的抗氧化能力[8]。高光強還可通過促進光合產物生成，增加AsA合成前體，從而促進AsA的積累[9]。

連續(xù)光照通常是指改變植物原有的明暗交替的光周期規(guī)律，給植物提供連續(xù)24 h或超過24 h的光照[10]。已有研究表明，生菜體內AsA含量與供氮和光照條件密切相關，在采收前進行一定強度的短期連續(xù)光照可以顯著提升水培葉菜的營養(yǎng)品質[11]。周晚來[12]研究發(fā)現，在生菜采收前，進行短期連續(xù)光照可以顯著提高AsA等營養(yǎng)物質的含量。生菜是一種被人們廣泛食用的全球性葉菜類蔬菜，在設施園藝中栽培廣泛，也是人工光植物工廠廣泛種植的代表性蔬菜[13]。本研究設想在生菜生長過程中，通過研究采前LED紅藍光連續(xù)光照光強對三種氮水平下生菜AsA含量和相關合成代謝的酶活性的影響，探究氮水平與光強對AsA含量和AsA相關代謝網絡的變化機理以及對采前連續(xù)光照的響應，為植物工廠中高產優(yōu)質蔬菜的生產和生產中光環(huán)境和氮營養(yǎng)的調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗在中國農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所植物工廠進行。試驗采取水培方式，種植環(huán)境溫度為25±1 ℃，相對濕度為65%±5%，CO2濃度為大氣CO2濃度。試驗以生菜(Lactucasativa)為試驗材料，品種為“意大利耐抽薹”。

1.2 試驗設計

將生菜種子播于海綿塊中育苗，培養(yǎng)15 d后將長勢一致的生菜苗隨機移栽于長方形塑料栽培槽(長180 cm×寬60 cm×高6 cm)內，并于次日開始光照試驗。試驗期間采用營養(yǎng)液水培，營養(yǎng)液采用霍格蘭配方。試驗前期正常光照采用LED紅藍光面板燈進行光照處理，紅藍光比例為4∶1，如表1所示，前期設置2種光強(100、150 μmol·m-2·s-1，I100、I150)和3種氮水平(2.5、5、7.5 mmol/L，N2.5、N5、N7.5),通過調節(jié)營養(yǎng)液中硝酸鈣的濃度來控制氮水平。試驗首先在常規(guī)光周期(16/8 h)下栽培17 d，在第18 d開始進行連續(xù)光照處理，連續(xù)光照處理的光照強度統(tǒng)一調至為150 μmol·m-2·s-1。

表1 常規(guī)光周期下的試驗參數

1.3 測定方法

分別于每個處理中隨機選8株生菜作為重復樣本，從莖基部切開，其中4株的地上部分將葉片與葉柄分離后，迅速用液氮冷凍，并用高通量組織研磨器在低溫下把用液氮冷凍好的植物樣品研磨成粉末，放至-80 ℃冰箱中留樣備用。

AsA含量采用Gillespie[14]的方法測定。L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶(GalLDH)活性參照Li[15]的方法測定。AsA過氧化物酶(APX)活性參照Nakano[16]的方法測定。AsA還原酶(DHAR)、單脫氫AsA還原酶(MDHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性參照Ma[17]的方法測定。

2 試驗結果

2.1 采前LED連續(xù)光照光強對三種氮水平處理下生菜AsA含量的影響

由表2可得，連續(xù)光照前，N2.5I100下的AsA含量最低為0.68 mg·g-1，N7.5I150下抗壞血酸含量最高為1.37 mg·g-1。連續(xù)光照后，N5I100下的AsA含量增幅最低為12.79%，N2.5I100下的抗壞血酸增幅最高為39.71%。連續(xù)光照前后，同一光強下，AsA含量隨著氮水平的升高而升高。同一氮水平下，I150下的抗壞血酸含量明顯高于I100處理。連續(xù)光照前后，氮水平與光強處理下生菜葉柄的AsA含量均無顯著差異。

由表3可知，連續(xù)光照前，光強與三種氮水平處理對生菜葉片的DHA含量具有顯著影響。光照強度為150 μmol·m-2·s-1時，氮水平處理對生菜葉片具有顯著影響，氮水平2.5 mmol/L處理下的DHA含量顯著高于其他兩個氮水平處理。光強與三種氮水平處理下生菜葉柄的DHA含量無顯著差異。連續(xù)光照后，各處理下葉片和葉柄的DHA含量均無顯著影響?？梢?，150 μmol·m-2·s-1的連續(xù)光照處理對水培生菜DHA的含量無顯著影響。

表2 采前LED連續(xù)光照光強對三種氮水平處理下生菜AsA的影響

表3 采前LED連續(xù)光照光強對三種氮水平處理下生菜DHA的影響

2.2 采前連續(xù)光照光強對三種氮水平處理下生菜AsA代謝相關酶活性的影響

由表4可知，連續(xù)光照前，光強與三種氮水平處理對生菜葉片的GalLDH酶活性含量沒有顯著影響。N2.5I150處理下葉柄的GalLDH酶活性最大為0.209 U mg-1FW，光照強度為150 μmol·m-2·s-1時，生菜葉柄GalLDH酶活性隨氮水平的升高呈現先降低后升高的趨勢。連續(xù)光照后，光強與三種氮水平處理下生菜葉片和葉柄的GalLDH酶活性均無顯著差異。可見，150 μmol·m-2·s-1的連續(xù)光照處理對水培生菜GalLDH酶活性無顯著影響。

由表5可知，連續(xù)光照前，光強與三種氮水平處理對生菜葉片的APX酶活性含量具有顯著影響。N2.5I150處理下葉片的APX酶活性最小為0.297 U mg-1FW，N7.5I150處理下葉片的APX酶活性最大達到0.468 U mg-1FW。同一生長光強處理下，氮水平2.5 mmol/L處理下生菜葉片的APX酶活性最低。連續(xù)光照后，光強為100 μmol·m-2·s-1時，氮水平對生菜葉片的APX酶活性無顯著影響。光強為150 μmol·m-2·s-1時，生菜葉片的APX酶活性隨氮水平的升高呈現先降低后升高的趨勢。N7.5I150處理下的生菜葉片APX酶活性最大為0.784 U mg-1FW，N5I150處理下的生菜葉片APX酶活性最小為0.423 U mg-1FW。連續(xù)光照前后，各處理下的生菜葉柄的APX酶活性均無顯著差異。說明150 μmol·m-2·s-1的連續(xù)光照光強及三種氮水平處理對生菜葉柄的APX酶活性無顯著影響。

表4 采前LED連續(xù)光照光強對三種氮水平處理下生菜GalLDH酶活性的影響

表5 采前LED連續(xù)光照光強對三種氮水平處理下生菜APX酶活性的影響

由表6可知，連續(xù)光照前，光強與三種氮水平處理對生菜葉片的MDHAR酶活性含量沒有顯著影響。連續(xù)光照后，光強為150 μmol·m-2·s-1時，氮水平處理對生菜葉片的MDHAR酶活性無顯著影響。光強為100 μmol·m-2·s-1時，氮水平5 mmol/L處理下生菜葉片的MDHAR酶活性顯著高于其他兩個氮水平處理下的。整體來看，N7.5I150處理下的生菜葉片MDHAR酶活性最大為3.56 U mg-1FW，N2.5I100處理下的生菜葉片APX酶活性最小為2.86 U mg-1FW。連續(xù)光照前后，各處理下的生菜葉柄的MDHAR酶活性均無顯著差異。說明150 μmol·m-2·s-1的連續(xù)光照光強及三種氮水平處理對生菜葉柄的MDHAR酶活性無顯著影響。

表6 采前LED連續(xù)光照光強對三種氮水平處理下生菜MDHAR酶活性的影響

由表7可知，連續(xù)光照前，光強與三種氮水平處理對生菜葉片的DHAR酶活性含量具有顯著影響。N7.5I150處理下葉片的DHAR酶活性最小為1.35 U mg-1FW，N2.5I150處理下葉片的DHAR酶活性最大達到1.80 U mg-1FW。連續(xù)光照后，同一生長光強下，營養(yǎng)液氮水平對生菜葉片的DHAR酶活性無顯著影響。同一氮水平下，150 μmol·m-2·s-1處理下的DHAR酶活性高于100 μmol·m-2·s-1處理。連續(xù)光照后，各處理下的生菜葉柄的DHAR酶活性均無顯著差異。說明150 μmol·m-2·s-1的連續(xù)光照光強及三種氮水平處理對生菜葉柄的DHAR酶活性無顯著影響。

表7 采前LED連續(xù)光照光強對三種氮水平處理下生菜DHAR酶活性的影響

由表8可知，連續(xù)光照前，光強與三種氮水平處理對生菜葉片和葉柄的GR酶活性含量具有顯著影響。光強為150 μmol·m-2·s-1時，氮水平7.5 mmol/L處理下生菜葉片的GR酶活性高于其他兩個氮水平處理。總體來看，連續(xù)光照前，N7.5I150處理下葉片的GR酶活性最大為0.570 U mg-1FW，N2.5I150處理下葉片的GR酶活性最小為0.367 U mg-1FW。N2.5I150處理下葉柄的GR酶活性最大為0.100 U mg-1FW，N5I100處理下葉柄的GR酶活性最小為0.053 U mg-1FW。連續(xù)光照后，各處理下的生菜葉片和葉柄的GR酶活性均無顯著差異。

表8 采前LED連續(xù)光照光強對三種氮水平處理下生菜GR酶活性的影響

3 討論

連續(xù)光照處理顯著促進了三種氮水平水培生菜AsA的積累，AsA含量的增加主要受氮水平的影響，低氮水平時抗壞血酸含量的增幅較高，這與余意等[18]的研究結果一致。Zhou等[19]研究發(fā)現，水培生菜采收前經過72 h連續(xù)光照后，生菜葉片的AsA含量顯著提高，與本試驗結果一致?？箟难岷铣纱x中的GalLDH合成酶、APX氧化酶和DHAR還原酶等的編碼基因具有光誘導性, 在連續(xù)光照或強光照射處理下,相關基因的表達量增加[20], 從而使抗壞血酸合成加快。研究表明，植物體內的主要合成途徑是L-半乳糖途徑，Gal LDH是此途徑中催化AsA合成的最后一個關鍵酶，在AsA的生物合成上起著至關重要的作用。GalLDH酶活性與AsA含量之間的關系會因植物種類、環(huán)境條件以及組織器官的不同而產生差異[21]。

一些研究表明，AsA含量的高低主要與APX、MDHAR、DHAR和GR等酶活性的高低有關[22]。本研究發(fā)現，連續(xù)光照前后，高氮高光強處理下生菜的AsA含量較高；連續(xù)光照后，高氮高光強處理下DHA的含量較低。連續(xù)光照前后，各處理間的葉片GalLDH酶活性無顯著差異，說明在本試驗中GalLDH酶對AsA的合成沒有顯著影響。由于APX是催化AsA氧化的酶，其活性的增加將消耗更多的AsA。然而，在許多研究[23]以及本研究中APX活性的升高往往伴隨著AsA含量的增加。連續(xù)光照前后，葉片APX酶活性在高氮高光強處理下的活性更高，與AsA含量的變化趨勢一致，說明氮水平和光強越高，APX酶活性越高，催化生成AsA的量越多。連續(xù)光照前，葉片MDHAR在高氮高光強處理下的活性略微升高，說明在本試驗中MDHAR酶對AsA的合成沒有顯著影響。連續(xù)光照后，MDHAR酶活性在高氮高光強處理下的活性更高，與AsA含量的變化趨勢一致，說明氮水平和光強越高，催化分解為DHA那部分的MDHA轉化合成AsA的量越多。連續(xù)光照前，葉片DHAR在在高氮高光強處理下的活性降低，與AsA含量的變化趨勢相反，說明在本試驗中，連續(xù)光照前，DHAR酶對AsA的合成沒有影響。連續(xù)光照后，DHAR酶活性在高氮高光強處理下的活性更高，與AsA含量的變化趨勢一致。DHAR酶活性越高，催化分解為2,3-二酮古洛糖酸那部分DHA轉化合成AsA的量越多。因此，連續(xù)光照前，氮水平與光強的影響可能是與參與AsA再生循環(huán)系統(tǒng)的MDHAR酶活性相關。連續(xù)光照后，氮水平與連續(xù)光照光強的影響主要是與參與AsA再生循環(huán)系統(tǒng)的MDHAR和DHAR酶活性相關。