熊挺淋，應(yīng)夢慧，張麗莎，張曉剛

細(xì)胞融合參與許多組織器官的生成發(fā)育，如肌肉、骨骼和胎盤等的形成，在自然界發(fā)生率很低[1-3]。較早的干細(xì)胞移植治療促進(jìn)組織修復(fù)實(shí)驗中，觀察到了細(xì)胞融合現(xiàn)象[4,5]。之后許多研究證實(shí)，胚胎干細(xì)胞（ESCs）和成熟體細(xì)胞的雜交細(xì)胞，主要表現(xiàn)出多潛能ESCs的特點(diǎn)[6,7]，將雜交細(xì)胞移植入皮下后，能形成包含三個胚層細(xì)胞的畸胎瘤[8,9]，表明雜交細(xì)胞仍具有全能性。Matsuura等[10]將心肌細(xì)胞與非心肌細(xì)胞融合后，雜交細(xì)胞維持了心肌細(xì)胞的特點(diǎn)，并能重新回到細(xì)胞循環(huán)中。可見，細(xì)胞融合可能成為再生醫(yī)學(xué)的一種有效方法。

心肌細(xì)胞在缺血、缺氧和損傷等病理條件下死亡后，只能靠其他心肌細(xì)胞的過度肥大來代償，但這種代償機(jī)制本身對心臟不利，因此心肌細(xì)胞的再生研究成為了臨床醫(yī)生的棘手問題。ESCs具有全能分化性，體外可分化為起搏細(xì)胞、心房細(xì)胞、心室細(xì)胞或蒲氏細(xì)胞等多種心肌組織細(xì)胞[11]，但ESCs移植入體內(nèi)存在著致畸胎瘤的風(fēng)險，同時其固有的免疫原性和倫理道德問題使其研究和應(yīng)用受到限制。Yamanaka等[12]成功將體細(xì)胞重編程為具有類似胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，解決了ESCs用于移植治療時存在的免疫排斥及倫理難題，且也能夠定向分化為心肌細(xì)胞，但是，體外自然分化為心肌細(xì)胞的能力低于ESCs[13]，本實(shí)驗在體外研究iPSCs與心肌細(xì)胞通過聚乙二醇介導(dǎo)融合，檢測雜交細(xì)胞的心肌細(xì)胞分化效率。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗動物及細(xì)胞株出生1～3 d的新生乳鼠及懷孕12.5～14.5 d的孕鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶基因缺陷和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因（Oct-4）的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞株購自中國科學(xué)院動物研究所。

1.2 主要試劑和儀器DMEM-H培養(yǎng)基、HAT選擇培養(yǎng)基、10% FBS購自Gibco；β-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、胰酶、膠原酶、1%的牛血清白蛋白、DAPI購自Sigma；白血病抑制因子（LIF）購自Millipore；絲裂霉素C、多聚甲醛、聚乙二醇購自Roche；秋水仙素、吉姆薩染液、0.1% Triton X-100、Gold view購自Genview；甲醇、冰醋酸、0.56% KCL購自北京鼎國生物工程公司；cTnT單克隆抗體、Tritc標(biāo)記的兔抗山羊IgG熒光二抗購自Santa cruz；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶、Tap聚合酶購自Takara；RT-PCR所用引物由Invitrogen公司合成；S1000Tm Thermal cycler逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由BIO-RAD公司提供；顯微鏡由Olympus公司提供。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 iPSCs培養(yǎng)iPSCs接種在事先經(jīng)絲裂霉素C處理過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上，培養(yǎng)方法及培養(yǎng)條件同前[14]，細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1000 IU/mL LIF、0.1mmol/L β-巰基乙醇、0.1 mmol/L L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸的DMEM-H中。

1.3.2 心肌細(xì)胞提取和培養(yǎng)新生乳鼠取出心臟，放在無菌的預(yù)冷PBS中，去除心包，將心肌組織剪成碎塊，用膠原酶消化2次，15 min/次，再用0.1%胰酶消化3次，6 min/次，分別收集消化液，用含10%FBS的DMEM-H培養(yǎng)基分別中和、離心和重懸細(xì)胞，差異貼壁1 h后分離培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞融合iPSCs與心肌細(xì)胞混合，離心棄上清，用PBS沖洗一次，加入1 ml預(yù)溫過的聚乙二醇，將細(xì)胞吹打并混勻，在37℃作用3 min，緩慢加入1 ml預(yù)溫過的無血清iPSCs培養(yǎng)基，在37℃作用1 min，再加入無血清iPSCs培養(yǎng)基3 mL，作用3 min，最后加入10 ml無血清iPSCs培養(yǎng)基，作用5 min，離心棄上清，用iPSCs完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種在事先經(jīng)絲裂霉素C處理過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上，24 h后換用含有1000 IU/ml LIF和0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇的HAT選擇培養(yǎng)基（10-4M次黃嘌呤、7×10-7M氨基蝶呤、10-3M胸腺嘧啶脫氧核苷）繼續(xù)培養(yǎng)雜交細(xì)胞，每1～2 d更換一次選擇培養(yǎng)基，以去掉死細(xì)胞?？笻AT的雜交細(xì)胞收獲后，采用標(biāo)準(zhǔn)的iPSCs方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.4 染色體核型分析含0.4 μg/ml秋水仙素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞3 h后收集雜交細(xì)胞，加入5 ml的0.56% KCL溶液，將細(xì)胞吹打均勻后，室溫放置30 min，加入3 ml新配置的固定液（甲醇：冰醋酸 3:1），輕輕混勻后，室溫下固定8 min，離心棄上清，加入 5 ml固定液并充分將細(xì)胞混勻，室溫下固定30 min，再次離心棄上清，加入0.3 ml固定液，將細(xì)胞吹打均勻并制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液滴于預(yù)冷的載玻片上（以每張載玻片3滴細(xì)胞懸液為宜），室溫晾干，用PBS稀釋10倍的吉姆薩染液染色15 min，自來水沖洗載玻片，文火烤干。顯微鏡下觀察、拍照，隨機(jī)取50個染色體計數(shù)。

1.3.5 擬胚體（EBs）的制備及向心肌細(xì)胞分化收集對數(shù)生長期的雜交細(xì)胞和iPSCs，EBs的制備參照Zhang法[15]進(jìn)行。EBs在體視學(xué)顯微鏡下吸出并接種，讓其貼壁生長，采用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換液，分別在EBs貼壁后第10 d、15 d、20 d、25 d和30 d時測定雜交細(xì)胞和iPSCs形成搏動EBs的比率。

1.3.6 RT-PCR細(xì)胞的總RNA采用TRIzol提取，提取的RNA保存在-80℃冰箱中。使用RNAiso Plus逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及S1000Tm Thermal cycler逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，PCR采用標(biāo)準(zhǔn)的25 μl擴(kuò)增體系，擴(kuò)增條件是：94℃變性30 s、94℃退火30 s、72℃ 延伸30 s，循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖做凝膠電泳分離條帶并用Gold view顯色，結(jié)果采用quantity one凝膠電泳儀進(jìn)行圖像半定量分析和數(shù)據(jù)處理。

1.3.7 免疫熒光細(xì)胞培養(yǎng)在玻璃載玻片上，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛在室溫條件下固定30 min，在室溫下用0.1% Triton X-100穿孔10 min，PBS洗3次，用1%的牛血清白蛋白封閉30 min，甩掉多于的封閉液，在37℃下用PBS稀釋的單克隆山羊抗心肌肌鈣蛋白T一抗（cTnT）（1:100）孵育2 h，一抗孵育后用PBS洗3次，在37℃下用PBS稀釋的Tritc標(biāo)記的兔抗山羊IgG二抗（1:100）孵育2 h，二抗孵育后用PBS洗3次，并用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，最后抗淬滅劑封片以及用熒光顯微鏡照相。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雜交細(xì)胞形態(tài)觀察聚乙二醇介導(dǎo)iPSCs和心肌細(xì)胞融合，在選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞融合4 d后見到成iPSCs樣生長的雜交細(xì)胞，呈集落樣生長，集落呈隆起的圓形、橢圓形或不規(guī)則形態(tài)，折光性強(qiáng)，界限和形態(tài)不清（圖1A），熒光顯微鏡下克隆團(tuán)呈現(xiàn)出綠色熒光（Oct-4啟動）（圖1B），表明雜交細(xì)胞保持了干細(xì)胞全能性。

圖1 雜交細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（×100）

2.2 染色體核型分析結(jié)果iPSCs和心肌細(xì)胞染色體數(shù)目為正常的二倍體核型，染色體數(shù)為40條。因此iPSCs與心肌細(xì)胞融合后，雜交細(xì)胞預(yù)期的染色體數(shù)目為80條，但本實(shí)驗結(jié)果表明，只有35%的雜交細(xì)胞染色體數(shù)目為80條，超過75%的雜交細(xì)胞染色體數(shù)目在76～80條之間，近25%的雜交細(xì)胞染色體數(shù)目變異較大（圖2）。

圖2 雜交細(xì)胞染色體數(shù)分布情況

2.3 RT-PCR結(jié)果干細(xì)胞特異性基因Oct-4和Nanog在iPSCs和雜交細(xì)胞中成陽性表達(dá)，心肌細(xì)胞中成陰性表達(dá)；半定量分析結(jié)果顯示，與iPSCs相比，Oct-4在雜交細(xì)胞中的表達(dá)量沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），Nanog的表達(dá)在P1代雜交細(xì)胞中低于iPSCs（P＜0.05），其他時間點(diǎn)與iPSCs無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而心肌細(xì)胞中Oct-4和Nanog的表達(dá)明顯低于iPSCs（P＜0.05）。心肌細(xì)胞特異性基因α-MHC和β-MHC在心肌細(xì)胞中成陽性表達(dá)，在iPSCs中表達(dá)陰性，在雜交細(xì)胞初期，α-MHC和β-MHC表達(dá)陽性，隨著時間延長，表達(dá)量逐漸降低，到P3代以后的雜交細(xì)胞不表達(dá)β-MHC，P5代以后的雜交細(xì)胞不表達(dá)α-MHC；半定量分析結(jié)果顯示，與心肌細(xì)胞相比，α-MHC和β-MHC在iPSCs、P3、P5、P7代雜交細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于心肌細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（圖3）。

圖3 RT-PCR半定量分析結(jié)果

2.4 免疫熒光結(jié)果免疫熒光分析表明Oct-4在iPSCs和雜交細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，在心肌細(xì)胞中呈陰性表達(dá)（圖4A、C）。cTnT在心肌細(xì)胞中陽性表達(dá)，在iPSCs中陰性表達(dá)，在早期雜交細(xì)胞中呈陽性表達(dá)（圖4B、C），而P3代以后的雜交細(xì)胞呈陰性表達(dá)。隨著時間的延長，cTnT在雜交細(xì)胞克隆中的陽性表達(dá)逐漸降低，在P3代雜交細(xì)胞時，陽性率降到26%。因此，免疫熒光結(jié)果表明，大多雜交細(xì)胞初期表現(xiàn)為iPSCs和心肌細(xì)胞的特點(diǎn)，P3代以后失去心肌細(xì)胞表型，而維持了干細(xì)胞的特點(diǎn)。

圖4 免疫熒光結(jié)果（×400）

2.5 雜交細(xì)胞分化而來的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在體外懸浮培養(yǎng)條件下（圖5A），雜交細(xì)胞能夠形成EBs，說明雜交細(xì)胞在體外仍具有多能性。經(jīng)懸浮培養(yǎng)形成的EBs，大小較一致，呈立體球形，邊緣較光滑。隨著分化天數(shù)的增加，EBs體積逐漸增大，少量EBs出現(xiàn)融合，貼壁后，EBs鋪開生長，在外圍分化出上皮樣形態(tài)細(xì)胞，最早在第8 d出現(xiàn)搏動區(qū)域，表現(xiàn)為個別EBs局部的搏動，頻率較快，約90～120 次/min。隨著分化天數(shù)的增加，各組出現(xiàn)搏動的擬胚體逐漸增多，在分化的第14～20 d，搏動的擬胚體數(shù)達(dá)到高峰，但是搏動頻率降低，約40～60 次/min（圖5B、C）。

圖5 分化心肌細(xì)胞觀察

2.6 雜交細(xì)胞與iPSCs向心肌細(xì)胞分化效率的比較采用懸浮培養(yǎng)法，雜交細(xì)胞能夠形成EBs，連續(xù)觀察30 d EBs搏動情況，結(jié)果表明雜交細(xì)胞和iPSCs均能形成搏動的EBs（心肌細(xì)胞分化），兩種細(xì)胞都在第20～25 d間達(dá)到心肌細(xì)胞分化效率的最高值，分化培養(yǎng)10 d及15 d時的雜交細(xì)胞心肌細(xì)胞分化率與iPSCs無明顯差異（P＞0.05），分化培養(yǎng)20 d、25 d及30 d時的雜交細(xì)胞心肌細(xì)胞分化率明顯高于iPSCs，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），圖6。

圖6 雜交細(xì)胞和iPSCs的心肌細(xì)胞分化率比較

3 討論

iPSCs來源于自身成體細(xì)胞的逆分化，不存在倫理道德及免疫排斥問題，目前尚未見iPSCs與心肌細(xì)胞的融合實(shí)驗報道，因此找到一種既具有無限增殖能力，又具有心肌細(xì)胞功能的雜交細(xì)胞是再生醫(yī)學(xué)的需要。本研究在體外通過聚乙二醇介導(dǎo)構(gòu)建iPSCs和心肌細(xì)胞的雜交細(xì)胞，雜交細(xì)胞無論是生長特點(diǎn)還是基因、蛋白表達(dá)層面均與iPSCs相似。本研究的雜交細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)與胚胎干細(xì)胞和成體細(xì)胞的雜交細(xì)胞表現(xiàn)出單向胚胎干細(xì)胞特點(diǎn)的結(jié)果一致[16,17]。也有研究表明，二倍體胚胎干細(xì)胞和四倍體成纖維細(xì)胞的雜交細(xì)胞顯示出單向成纖維細(xì)胞的特征[18]，可能是由所選親本細(xì)胞的染色體倍性不同引起的。兩個二倍體親本細(xì)胞的雜交細(xì)胞，理論上應(yīng)為四倍體的核型，預(yù)期的染色體數(shù)應(yīng)該是兩親本細(xì)胞之和。本研究中，二倍體iPSCs與二倍體心肌細(xì)胞的雜交細(xì)胞，大多表現(xiàn)出近似四倍體的核型，而少部分雜交細(xì)胞染色體數(shù)只有60～70條之間，甚至更少，說明在這一過程中可能存在親本染色體的丟失或融合不完全[19]。

所有的雜交細(xì)胞均表達(dá)干細(xì)胞特異性的基因和蛋白，而心肌特異性基因和蛋白只在早期的雜交細(xì)胞中表達(dá)，后期的雜交細(xì)胞呈陰性表達(dá)，這種趨勢變化可能是由于干細(xì)胞相關(guān)基因或因子使基因去甲基化后重新表達(dá)，或者甲基化而致基因表達(dá)沉默造成的[20,21]。Oct-4和Nanog是維持干細(xì)胞多能性的關(guān)鍵基因，雜交細(xì)胞不僅表達(dá)Oct-4和Nanog，且在體外也能形成EBs，說明雜交細(xì)胞仍然保持了多潛能性[22,23]。我們采用經(jīng)典的懸浮培養(yǎng)EBs法誘導(dǎo)雜交細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，以檢測雜交細(xì)胞和iPSCs的心肌細(xì)胞分化能力。實(shí)驗結(jié)果表明，兩種細(xì)胞均能分化為搏動的心肌細(xì)胞，在相同培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件下雜交細(xì)胞的心肌細(xì)胞分化率高于iPSCs。以往研究結(jié)果可能用于解釋雜交細(xì)胞分化率提高的原理，這是我們需進(jìn)一步研究的方向：①Nkx2.5、GATA-4、Tbx5/20、Mef2c、Myocardin、HAND等早期心肌轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控心肌特異性基因和蛋白的表達(dá)，是ESCs向心肌細(xì)胞分化的啟動因子[24]。此外，如TGF-b、BMP、Wnt家族蛋白、FGF等心肌發(fā)生相關(guān)因子可以促進(jìn)ESCs分化為心肌細(xì)胞，提高心肌細(xì)胞的分化效率[25,26]。有發(fā)現(xiàn)Notch 受體的上調(diào)可抑制小鼠ESCs 的心肌分化，而下調(diào)則能提高心肌細(xì)胞分化的效率[27]。②外源性心肌細(xì)胞基因組的加入可能也是導(dǎo)致雜交細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化率提高的原因。③表觀遺傳修飾可以通過特定酶調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化過程中特定基因的沉默或活化，并影響分化過程；DNA去甲基化和組蛋白乙?；{(diào)節(jié)ESCs向心肌細(xì)胞分化的過程[28]。

研究表明，iPSCs向心肌細(xì)胞的分化過程中，伴隨心肌骨架蛋白、肌聯(lián)蛋白、α輔肌動蛋白、cTnT的表達(dá)[13]，本試驗檢測到EBs中伴隨心肌特異基因α-MHC和β-MHC mRNA及心肌特異性蛋白cTnT的表達(dá)，在基因及蛋白水平鑒定了雜交細(xì)胞分化而來的心肌細(xì)胞。本研究中，雜交細(xì)胞能夠向心肌細(xì)胞分化，但由于我們檢測方法所限，目前并不清楚這種分化是親本心肌細(xì)胞重新表達(dá)（親本心肌細(xì)胞基因被重編程或者去甲基化），還是雜交細(xì)胞完全轉(zhuǎn)化為另外一種細(xì)胞。設(shè)想在心肌細(xì)胞引入外源性干細(xì)胞基因的的情況下，能否使心肌細(xì)胞內(nèi)原本“表達(dá)沉默”的干細(xì)胞相關(guān)基因（Oct4、Nanog等）被激活并重新表達(dá)。在不丟失心肌細(xì)胞表型的同時，并獲得增殖與分化能力。ESCs和成體細(xì)胞的雜交細(xì)胞的DNA甲基化分析結(jié)果表明，體細(xì)胞基因組被重編程到了ESCs狀態(tài)[29]。因此，雜交細(xì)胞的表觀遺傳修飾是以后值得重點(diǎn)研究的內(nèi)容。

由此可見，iPSCs與心肌細(xì)胞形成的雜交細(xì)胞表現(xiàn)為干細(xì)胞樣的生長特點(diǎn)，仍具有分化全能性。雜交細(xì)胞能夠向心肌細(xì)胞分化，在相同培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件下，雜交細(xì)胞的心肌細(xì)胞分化效率高于iPSCs，分化心肌細(xì)胞中心肌細(xì)胞特異性基因和蛋白呈陽性表達(dá)。但雜交細(xì)胞失去心肌細(xì)胞特點(diǎn)，這種改變是親本心肌細(xì)胞基因組被重編程，還是化學(xué)促融劑對心肌細(xì)胞生長造成的影響，尚不清楚，下一步的研究方向是采用不同促融方法誘導(dǎo)融合（如電融合法、離心振動法），檢測雜交細(xì)胞的分子生物學(xué)功能。