夏宏娟 美麗姑·買買提 徐 麗

(新疆軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤放療科，烏魯木齊市 830000，電子郵箱：xf6m0byp@163.com)

結(jié)腸癌是一種消化道惡性腫瘤，年輕人發(fā)病率和病死率逐年上升[1-2]。術(shù)前放療是其重要的輔助治療方式，若放療不敏感可能會延誤患者的手術(shù)治療[3]。組織或細(xì)胞中微小RNA(microRNA，miRNA)的表達(dá)譜會因射線照射發(fā)生變化，最終誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，miRNA-205是常見的抑癌基因，在多種腫瘤中特異表達(dá)[4-6]。E盒結(jié)合鋅指蛋白1(zinc-finger E-box-binding homeobox 1,ZEB1)是一種鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)[7]。有研究顯示miRNA-205在ZEB1 3′非翻譯區(qū)中存在調(diào)控結(jié)合位點[8-9]，由此推測miRNA-205、ZEB1的表達(dá)可能與結(jié)腸癌的放療敏感性有關(guān)。本研究探討結(jié)腸癌患者血清miRNA-205、癌組織ZEB1的表達(dá)情況及兩者與放療敏感性的關(guān)系，以期為臨床確定治療方案提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2015年8月至2019年4月本院收治的90例結(jié)腸癌患者(結(jié)腸癌組)的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理學(xué)檢查確診，且均為首次確診者[10]；(2)臨床資料齊全者；(3)保留完整病理組織標(biāo)本者；(4)腫瘤遠(yuǎn)端距離肛緣≤10 cm者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有細(xì)胞分子靶向治療史患者；(2)有嚴(yán)重心、肝、腎等病變者；(3)有炎癥性腸病等結(jié)腸病變者；(4)哺乳、妊娠期婦女。患者年齡32～86(60.24±25.48)歲，男性50例、女性40例。另選取84例體檢者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡與結(jié)腸癌組相匹配，臨床資料齊全；(2)近3個月內(nèi)未服用過影響體檢指標(biāo)水平的藥物，且未接受過影響體檢結(jié)果的治療。排除標(biāo)準(zhǔn)同結(jié)腸癌組。對照組年齡35～86(60.31±22.48)歲，男48例、女36例。兩組的性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均自愿參加。

1.2 研究方法

1.2.1 術(shù)前放療方案及其敏感性評定：患者在結(jié)腸癌根治術(shù)前接受三維適形放療，放療前使用多層螺旋CT(購自日本Toshiba公司，型號：Aquilion ONE 320)對原發(fā)腫瘤進(jìn)行5 mm、10 mm層厚連續(xù)掃描，采用德國西門子Primus V7直線加速器行6 MV X線照射，選擇6～8個共面及非共面視野適度照射，1.8～2.0 Gy/次，兩次照射之間間隔1 d，總照射劑量為40～50 Gy，療程持續(xù)2周。根據(jù)世界衛(wèi)生組織制定的標(biāo)準(zhǔn)[11]評定放療敏感性：放療后行CT掃描檢查，病灶最大徑較化療前增大>20%或出現(xiàn)病灶轉(zhuǎn)移為惡化，放療后病灶最大徑較化療前減少<30%或增大<20%為穩(wěn)定，放療后病灶最大徑較化療前減少≥30%為部分緩解，放療后病灶消失為完全緩解。9例結(jié)腸癌患者中，46例部分緩解或完全緩解,判定為放療敏感，納入放療敏感組；44例穩(wěn)定或惡化，判定為放療不敏感，納入放療不敏感組。

1.2.2 樣品采集及保存：采集結(jié)腸癌患者放療前及體檢者體檢時的清晨空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min(離心半徑15 cm)后收集血清，置于-80℃環(huán)境中保存。另取結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織及其中84例患者的癌旁腸黏膜組織(距離病灶組織邊緣5 cm左右)作為對照，10%福爾馬林固定標(biāo)本后，進(jìn)行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋及切片(厚度4 μm)，室溫保存。

1.2.3 血清miRNA-205表達(dá)水平的檢測：采用RNA提取試劑盒(購自美國Life Technologies公司，生產(chǎn)批號：AM1556)提取血清總RNA，并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自上海杏園瑞民生物工程有限公司，生產(chǎn)批號：XY001180)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司(型號：CFX384)。PCR反應(yīng)體系為包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)2 μL(購自日本TaKaRa公司，生產(chǎn)批號：RR820A)，cDNA模板(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL(引物由南京金斯瑞生物科技公司合成，引物序列為:miRNA-205上游引物5′-3′GGAGCGAGGCTTGCTGCAG，下游引物5′-3′GAGACCCTGCTATGCGAGCA；U6上游引物5′-3′CAGGCAGCTCATGGTCATCG， 下游引物5′-3′GACACAGCTCAGGCTGCTAC)，ddH2O 6.2 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對血清miRNA-205的相對表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.2.4 免疫組化法檢測結(jié)腸癌組織和癌旁腸黏膜組織中ZEB1的表達(dá)：采用免疫組化法檢測結(jié)腸癌組織或癌旁腸黏膜組織標(biāo)本中ZEB1的表達(dá)情況。免疫組化試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司(生產(chǎn)批號：ZC-53964)，ZEB1抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司(生產(chǎn)批號：FNab09620)，操作步驟參考聶美楠等[12]的方法。在光學(xué)顯微鏡(購自日本Olympus公司，型號：CX23)高倍鏡下(200×)，隨機(jī)觀察5個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。采用雙評分半定量法判定結(jié)果，細(xì)胞核染色強(qiáng)度評分結(jié)果包括3分(強(qiáng)染色，棕褐色)、2分(中染色，黃褐色)、1分(弱染色，淺黃色)、0分(無染色)；陽性細(xì)胞占比評分結(jié)果包括0分(<25%)、1分(25%～50%)、2分(51%～75%)、3分(>75%)。兩項得分相乘>3分視為陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用成組設(shè)計兩獨立樣本t檢驗或t′檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)和/或百分比表示，比較采用χ2檢驗；采用Logistic回歸模型分析影響結(jié)腸癌患者放療敏感性的因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸癌組和對照組之間血清miRNA-205表達(dá)水平及不同組織中ZEB1陽性表達(dá)情況的比較 結(jié)腸癌組、對照組血清miRNA-205的相對表達(dá)水平分別為2.52±0.47、1.00±0.23，前者高于后者(t′=27.373，P<0.001)。 癌組織、癌旁組織的ZEB1陽性表達(dá)率分別為51.11%(46/90)、14.29%(12/84)，前者高于后者(χ2=26.514，P<0.001)。

2.2 不同臨床病理特征結(jié)腸癌患者血清miRNA-205相對表達(dá)水平、癌組織ZEB1表達(dá)情況的比較 90例結(jié)腸癌患者中，癌組織ZEB1表達(dá)陽性46例，ZEB1表達(dá)陰性44例。血清miRNA-205相對表達(dá)水平可能與病理類型、局部浸潤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、腫瘤大體類型及病變部位有關(guān)(均P<0.05)。癌組織ZEB1表達(dá)情況可能與局部浸潤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、腫瘤大體類型及病變部位有關(guān)(均P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征結(jié)腸癌患者miRNA-205相對表達(dá)水平、ZEB1表達(dá)情況的比較

2.3 放療敏感組和放療不敏感組血清miRNA-205相對表達(dá)水平、癌組織ZEB1表達(dá)情況 放療敏感組血清miRNA-205的相對表達(dá)水平及癌組織ZEB1陽性表達(dá)率均更低(均P<0.05)。見表2。

表2 結(jié)腸癌患者miRNA-205相對表達(dá)水平、ZEB1表達(dá)情況與放療敏感性的關(guān)系

2.4 影響結(jié)腸癌患者放療敏感性的多因素Logistic回歸分析 以結(jié)腸癌患者放療后是否敏感為因變量，以性別、年齡、病理類型、局部浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤大體類型、病變部位、血清miRNA-205相對表達(dá)水平、癌組織ZEB1表達(dá)情況作為自變量(變量賦值見表3)，納入二元Logistic回歸模型中進(jìn)行多因素分析。結(jié)果顯示：癌組織中ZEB1表達(dá)情況和TNM分期是影響結(jié)腸癌患者放療敏感性的因素(均P<0.05)，其中ZEB1陽性表達(dá)、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的患者對放療更不敏感。見表4。

表3 變量賦值情況

表4 影響結(jié)腸癌患者放療敏感性的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其特點為復(fù)發(fā)率高和易轉(zhuǎn)移[13]。放療是結(jié)腸癌主要的輔助治療方式，其敏感性易隨相關(guān)基因的改變和腫瘤微環(huán)境的變化而變化，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，該現(xiàn)象被稱為放療抵抗[14-15]。因此，評估患者放療敏感性對于提高治療效果十分重要。

miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，例如下調(diào)miRNA-96表達(dá)能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及侵襲[16]。本研究中，結(jié)腸癌組的血清miRNA-205相對表達(dá)水平高于對照組，且可能與病理類型、局部浸潤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、腫瘤大體類型有關(guān)(均P<0.05)，由此推測miRNA-205可能通過沉默癌細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)來影響癌細(xì)胞的生長和代謝，影響結(jié)腸癌的發(fā)病和病情程度。 放療可誘導(dǎo)癌細(xì)胞miRNA發(fā)生差異表達(dá)[17-19]，而miRNA的表達(dá)變化也會影響放療的效果。例如，Hou等[20]的研究表明，輻射可顯著激活膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的自噬并降低miRNA-17-5p的表達(dá)水平，且miRNA-17-5p上調(diào)使異種移植瘤對輻射敏感；Li等[21]發(fā)現(xiàn)，miRNA-320可通過靶向調(diào)節(jié)Fox M1的表達(dá)來增強(qiáng)膠質(zhì)瘤的放療效果。本研究結(jié)果顯示，放療敏感的結(jié)腸癌患者血清miRNA-205的表達(dá)水平更低(P<0.05)，這表明miRNA-205的表達(dá)或可影響結(jié)腸癌患者的放療敏感性。

ZEB1可通過調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)來提高腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[22-23]。李衛(wèi)奇等[24]的研究表明結(jié)腸癌組織中的ZEB1可能參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌患者癌組織中的ZEB1陽性表達(dá)率高于癌旁組織，且癌組織的ZEB1表達(dá)陽性情況可能與局部浸潤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、腫瘤大體類型有關(guān)(均P<0.05)。這提示ZEB1可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生，并促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等。有研究表明，ZEB1可作為預(yù)測食管癌患者放療敏感性的分子標(biāo)志物[25]。本研究中，放療敏感的結(jié)腸癌患者的癌組織ZEB1陽性表達(dá)率更低(P<0.05)，Logistic回歸分析結(jié)果也提示癌組織ZEB1陽性表達(dá)與結(jié)腸癌患者的放療敏感相關(guān)(P<0.05)，這提示ZEB1的陽性表達(dá)可能共同參與了結(jié)腸癌的放射性抗拒。

綜上所述，結(jié)腸癌患者的miRNA-205和ZEB1的表達(dá)均上調(diào)，兩者可能共同參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，并不同程度地影響放療敏感性，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。