李翠娟 唐 穎 彭翠蘭 慕麗娜 楊 雪 王春波 李 佳 王琳琳

(黑龍江省大慶龍南醫(yī)院呼吸內(nèi)科，大慶市 163453，電子郵箱：juanli085338@163.com)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以不完全可逆的氣流受限為特征，反復發(fā)作的急性加重會加劇氣流受限，最終引起呼吸衰竭甚至死亡。目前，臨床上主要通過藥物、無創(chuàng)機械通氣、有氧運動等方法治療穩(wěn)定期COPD，以預防急性加重的發(fā)作，減輕氣流受限，進而提高患者的生活質(zhì)量、延長生存時間。在治療穩(wěn)定期COPD患者過程中，準確評估病情、及時發(fā)現(xiàn)具有較高急性加重和死亡風險的患者，對更好地制定診療方案有重要意義。

氣道炎癥反應的持續(xù)存在在COPD發(fā)病中起重要作用，多項研究表明腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-18等促炎細胞因子的大量分泌與COPD的發(fā)病有關[1-3]。有學者發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA)能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)炎癥基因的表達，其中miRNA-181a具有抑制炎癥作用，可抑制香煙提取物誘導大鼠肺泡巨噬細胞釋放TNF-α、IL-6、IL-8[4]。而臨床研究顯示穩(wěn)定期COPD患者體內(nèi)miRNA-181a的表達明顯減少[5]。低表達的miRNA-181a是否與COPD的炎癥激活、COPD的預后有關，目前尚未清楚。本研究探討穩(wěn)定期COPD患者外周血miRNA-181a表達情況，及其與預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年9月至2019年7月在我院就診的300例穩(wěn)定期COPD患者作為COPD組，納入標準：(1)符合穩(wěn)定期COPD的診斷標準[6]；(2)近8周臨床癥狀穩(wěn)定；(3)隨訪資料完整。排除標準：(1)合并呼吸道感染或正在使用抗生素治療者；(2)合并肺癌、肺結(jié)核等其他呼吸系統(tǒng)疾病者；(3)合并自身免疫性疾病、惡性腫瘤等患者。另選取同期體檢的150例健康志愿者作為對照組，兩組一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組一般資料的比較

1.2 研究方法

1.2.1 外周血miRNA-181a表達的檢測：采集COPD組患者入院后次日及對照組志愿者體檢當日的空腹靜脈血3～5 mL，采用miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化科技公司，批號：DP503)分離miRNA，然后采用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技公司，批號：KR201)進行反轉(zhuǎn)錄得到miRNA對應的cDNA。采用熒光定量檢測試劑盒(北京天根生化科技公司，批號：FP401)進行PCR實驗，以U6為內(nèi)參基因，按試劑盒說明書配置PCR的反應體系，包括cDNA 2 μL熒光定量檢測試劑盒內(nèi)的預混液10 μL、10 μmol/L的上下游引物各0.4 μL、去離子水補足至20.0 μL。于熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)完成PCR，反應條件為95℃ 15 min后94℃ 20 s、60℃ 34 s(重復40個循環(huán))。按照2-ΔΔCt計算miRNA-181a的表達量。

1.2.2 血清促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的檢測：采集COPD組患者入院后次日及對照組志愿者體檢當日的空腹靜脈血5～6 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(上海西唐公司，批號：F00024、F00019、F00142、F00242、F00137)檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18的水平，均按照試劑盒說明書進行檢測操作。

1.2.3 預后隨訪：隨訪時間為入組當天至2020年7月31日，共12～46個月，隨訪方式為每個月進行門診復查或電話回訪。隨訪的重點事件包括第一次發(fā)生急性加重、全因死亡。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；預后影響因素的分析采用Cox回歸模型。采用GraphPad Prism 5.0軟件進行Pearson檢驗、Kaplan-Meier曲線的繪制以及l(fā)og-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 COPD組與對照組miRNA-181a相對表達量和細胞因子水平的比較 與對照組比較，COPD組患者外周血miRNA-181a的相對表達量降低，血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平升高(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組miRNA-181a相對表達量和細胞因子水平的比較

2.2 COPD患者外周血miRNA-181a表達量與TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的相關性 COPD患者外周血miRNA-181a的表達量與血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平呈負相關(均P<0.05)。見表3。

表3 COPD患者外周血miRNA-181a表達量與TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的相關性

2.3 隨訪期間不同miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的COPD患者首次急性加重的發(fā)生情況 根據(jù)COPD患者miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18的中位數(shù)將其分為miRNA-181a高表達組與低表達組、細胞因子高水平組與低水平組。繪制Kaplan-Meier曲線并行l(wèi)og-rank檢驗，結(jié)果顯示，與miRNA-181a低表達患者比較，miRNA-181a高表達患者的急性加重累積發(fā)生率降低(P<0.05)；與TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18低水平患者比較，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18高水平患者的急性加重累積發(fā)生率相應增高(均P<0.05)。見圖1。

圖1 COPD組不同水平miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18患者急性加重情況的Kaplan-Meier曲線

2.4 隨訪期間不同miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的COPD患者的死亡情況 繪制Kaplan-Meier曲線并行l(wèi)og-rank檢驗，結(jié)果顯示，與miRNA-181a低水平患者比較，miRNA-181a高水平患者的累積病死率降低(P<0.05)；與TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18低水平患者比較，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18高水平患者的累積病死率相應增高(均P<0.05)。見圖2。

圖2 不同miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平COPD患者死亡情況的Kaplan-Meier曲線

2.5 COPD患者發(fā)生急性加重影響因素的Cox回歸分析 以COPD患者發(fā)生急性加重情況為應變量(未發(fā)生急性加重=0，發(fā)生急性加重=1)，以miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18為自變量(以實際測得值進入模型)，進行Cox回歸分析。結(jié)果顯示miRNA-181a表達量、TNF-α和IL-6水平是COPD患者發(fā)生急性加重的影響因素(均P<0.05)，見表4。

表4 COPD患者發(fā)生急性加重影響因素的Cox回歸分析

2.6 COPD患者死亡影響因素的Cox回歸分析 以COPD組患者死亡情況為應變量(存活=0，死亡=1)，以miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18為自變量(以實際測得值進入模型)，進行Cox回歸分析。結(jié)果顯示miRNA-181a表達量、IL-6和IL-18水平是COPD患者死亡的影響因素(均P<0.05)，見表5。

表5 COPD患者死亡影響因素的Cox回歸分析

3 討 論

COPD具有反復發(fā)作的特點，可導致氣道重塑及氣流不可逆受限加重，最終發(fā)展為呼吸衰竭、肺源性心臟病及死亡。準確評估COPD病情、預測可能發(fā)生急性加重的高?；颊?，對制定診療方案具有積極意義，從而有助于改善COPD患者生活質(zhì)量、延長生存時間、降低死亡率。肺功能測定、COPD評估測試評分是目前評價COPD病情的主要方法，但肺功能測定存在測定步驟復雜、需要重復多次檢查、可操作性不強等缺點，COPD評估測試評分具有受主觀判斷影響較大的不足，用于評估遠期預后的價值有限。

miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達并具有廣泛的生物學作用。多項研究顯示，COPD患者外周血中存在多種miRNA的表達，且對病情及預后具有一定的評估價值[5,7-8]。氣道慢性炎癥反應是COPD的基本病理生理特征，而TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18等促炎細胞因子生成增多在COPD的氣道炎癥中起重要作用[1-3,9-11]。研究顯示，miRNA-181a可以抑制炎癥，miRNA-181a的低表達與COPD的發(fā)生有關[4-5]。本研究結(jié)果顯示COPD患者血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平增加，外周血miRNA-181a表達量減少，且COPD患者外周血miRNA-181a的表達量與血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18的水平呈負相關(P<0.05)，提示在COPD的穩(wěn)定期，miRNA-181a呈低表達，并可以負調(diào)控多種促炎因子，進而介導氣道炎癥、引起氣流受限。

隨著氣流受限的加重，COPD患者出現(xiàn)病情急性加重甚至死亡[12]。多項研究顯示，TNF-α、IL-1β、IL-18、細胞間黏附分子1等炎癥指標對COPD患者的預后具有評估價值[13-15]。但COPD氣道炎癥的激活涉及復雜的細胞因子網(wǎng)絡，COPD患者體內(nèi)起促炎作用的細胞因子可能存在個體差異，單純根據(jù)一種或幾種促炎細胞因子對患者的病情進行預后評估具有一定的局限性。miRNA-181a作為炎癥反應的上游調(diào)控分子，同時參與多種促炎因子的調(diào)控，其在病情及預后的評估中可能有一定的價值。本研究結(jié)果顯示miRNA-181a低表達與穩(wěn)定期COPD患者急性加重累積發(fā)生率、累積病死率更高；進一步的Cox回歸分析結(jié)果顯示，miRNA-181a、TNF-α、IL-6是穩(wěn)定期COPD患者發(fā)生急性加重的影響因素，而miRNA-181a、IL-6、IL-18是穩(wěn)定期COPD患者死亡的影響因素。提示miRNA-181a低表達是穩(wěn)定期COPD患者不佳的危險因素，miRNA-181a或有助于評估穩(wěn)定期COPD患者的預后。

綜上所述，穩(wěn)定期COPD患者miRNA-181a表達降低，且與促炎細胞水平TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平呈負相關。miRNA-181a表達降低是穩(wěn)定期COPD患者發(fā)生急性加重或死亡的危險因素。但本研究為單中心研究且隨訪時間較短，今后將延長隨訪時間、進行多中心研究驗證結(jié)果。