馬雪蓮，李 慧，常 奕，王 箏，王香婷,，王琬瑤，許慶友

(1.河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091)

梗阻性腎病占成人慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)病因10%，也是兒童終末期腎病的首要病因[1]。炎性損傷和腎臟固有細(xì)胞損失是梗阻性腎病的重要原因。動(dòng)物研究表明，凋亡、自噬、壞死或細(xì)胞轉(zhuǎn)化可引起腎臟固有細(xì)胞急劇減少[2]。腎臟固有細(xì)胞損失可促進(jìn)腎臟纖維化和腎功能惡化。焦亡，一種新的可調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式，不僅導(dǎo)致細(xì)胞減少而且?guī)韲?yán)重炎癥損傷，近來在心血管和腎臟領(lǐng)域頗受關(guān)注。有報(bào)道稱梗阻性腎病時(shí)血漿醛固酮升高可導(dǎo)致腎臟巨噬細(xì)胞焦亡，而關(guān)于腎臟固有細(xì)胞焦亡少有研究。本實(shí)驗(yàn)采用醛固酮體外刺激人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK2)，觀察補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清及依普利酮對(duì)于DNA損傷、鹽皮質(zhì)激素受體NR3C2、血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1 (serum and glucocorticoid-induced protein kinase 1，SGK-1)、核因子кB(nuclear factor кB，NF-κB)、焦亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-like pyrin domain containing protein 3)、caspase-1和IL-1β的調(diào)控情況，研究補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清及依普利酮抑制鹽皮質(zhì)激素受體活化導(dǎo)致的HK2細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物依普利酮：購自美國Abcam公司(粉劑，批號(hào)APN12608-1-1)，用DMSO配制成100 mmol·L-1的溶液。醛固酮：購自美國Cayman公司(粉劑，批號(hào)0487439-4)，用無水乙醇配制成10 mmol·L-1溶液。補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清：5只Wistar大鼠，清潔級(jí)，♂，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證編號(hào)1605359)用于血清制備。補(bǔ)氣活血解毒方采用一方制藥公司(廣東)的配方顆粒劑，藥味包括金銀花(批號(hào)6020961)、黃芩(批號(hào)6033511)、黃芪 (批號(hào)403196T)、赤芍(批號(hào) 311400T)、醋鱉甲(批號(hào)6013581)、地龍(批號(hào)6033291)，質(zhì)量配伍比例為20 ∶18 ∶40 ∶20 ∶7 ∶10。該組方顆粒按1.92 g·kg-1大鼠質(zhì)量溶于3 mL蒸餾水，每日1次灌胃，共3日。末次給藥后1 h股靜脈取血分離血清并使用0.22 μm針孔過濾器過濾備用。

1.2 試劑與主要儀器TUNEL試劑盒(英國Eterlife公司，批號(hào)11422200)，NR3C2抗體(美國Proteintech公司，批號(hào)21854-1-AP)，SGK-1抗體(英國Abcam公司，批號(hào)GR197317-12)，NF-кB(p65)抗體(武漢Servicebio公司，批號(hào)181905)，IL-1β抗體(美國Novus公司，批號(hào)NB60-633)，caspase-1抗體(美國Proteintech公司，批號(hào)00046167)，NLRP3抗體(英國Eterlife公司，批號(hào)F1716)，DMEM培養(yǎng)液(美國GIBCO公司，批號(hào)8118319)。全自動(dòng)活細(xì)胞成像系統(tǒng)(美國Thermo Fisher scientific公司，型號(hào)EVOS FL Auto)，近紅外激光掃描成像儀(美國LI-COR公司，型號(hào)Odyssey)，半干轉(zhuǎn)膜儀(美國BIO-RAD公司，型號(hào)Semi-dry)，激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司，型號(hào)SP8)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)采用人近端腎小管上皮細(xì)胞HK2為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。細(xì)胞復(fù)蘇后置于培養(yǎng)皿，在DMEM培養(yǎng)液(體積分?jǐn)?shù)為1%青鏈霉素，8%牛血清)中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)。待細(xì)胞增殖為培養(yǎng)面積的60%-70%時(shí)制備單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶或細(xì)胞孔板繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)改為去血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化，最后在相應(yīng)藥物干預(yù)24 h后收集細(xì)胞檢測。干預(yù)藥物的濃度依據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)測試藥物的細(xì)胞毒性及參考文獻(xiàn)確定[3]。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組(Cont)：僅采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；醛固酮組(Ald)：DMEM培養(yǎng)基加醛固酮(終濃度1 μmol·L-1)；依普利酮干預(yù)組(EPL)：DMEM培養(yǎng)基加醛固酮(終濃度1 μmol·L-1)和依普利酮(10 μmol·L-1)；補(bǔ)氣活血解毒方干預(yù)組(TCM)：DMEM培養(yǎng)基加醛固酮(終濃度1 μmol·L-1)和體積分?jǐn)?shù)10%中藥血清。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1TUNEL檢測細(xì)胞死亡 4%多聚甲醛固定細(xì)胞后，滴加Triton-X 100冰浴2 min進(jìn)行細(xì)胞破膜；滴加TUNEL試劑孵育1 h(37 ℃、避光)；碘化丙啶復(fù)染細(xì)胞核，封片后使用全自動(dòng)活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察熒光(Ex：450-500 nm；Em：520-560 nm)。免疫熒光半定量分析：隨機(jī)選取每組細(xì)胞標(biāo)本TUNEL熒光圖片3張，計(jì)算每張圖片高倍鏡視野中陽性細(xì)胞數(shù)量，取陽性細(xì)胞數(shù)量平均值作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.5.2蛋白免疫印跡檢測SGK-1、NF-кB(p65)、IL-1β、caspase-1和NLRP3蛋白表達(dá)情況 胰酶消化細(xì)胞后PBS洗滌、離心，留取細(xì)胞沉淀，加入含有PMSF的細(xì)胞裂解液，冰浴30 min，震蕩吹打促進(jìn)裂解，離心留取含蛋白上清液，加入上樣緩沖液備用；制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白；使用半干轉(zhuǎn)膜儀使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到孔徑為0.22 μm的醋酸纖維素(PVDF)膜上；PVDF膜放入5%脫脂牛奶中封閉2 h后孵育不同一抗和內(nèi)參抗體GAPDH(稀釋比例為1 ∶200-1 ∶2 000)，4 ℃過夜；TBST清洗后滴加熒光標(biāo)記二抗(IR 680或IR 780)避光孵育1 h；TBST和TBS清洗后使用近紅外激光掃描成像儀觀察拍照，ImageJ軟件進(jìn)行蛋白定量。

1.5.3免疫熒光方法檢測HK2細(xì)胞的NR3C2、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)情況 PBS洗滌細(xì)胞后4%多聚甲醛固定，Triton-X 100孵育20 min破膜，滴加山羊血清孵育30 min，分別滴加第一抗體(稀釋比例為1 ∶50-1 ∶200)，4 ℃過夜；PBS溶液洗滌后室溫孵育熒光二抗(1 ∶200)1 h；DAPI復(fù)染、封片，采用活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察。免疫熒光半定量分析同“1.5.1”。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL染色檢測HK2細(xì)胞死亡TUNEL陽性標(biāo)記為綠色熒光細(xì)胞核，代表DNA斷裂的死亡細(xì)胞。Ald組與Cont組比較，陽性細(xì)胞數(shù)量增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，EPL和TCM組陽性細(xì)胞比Ald組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見Fig 1。

Fig 1 DNA damage evaluated by TUNEL **P<0.01 vs Cont,##P<0.01 vs Ald.

2.2 SGK-1、NF-кB(p65)和NR3C2蛋白表達(dá)情況免疫熒光顯示NR3C2表達(dá)：NR3C2被標(biāo)記為綠色熒光，NR3C2活化后由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核。與對(duì)照組比較，醛固酮刺激后NR3C2的細(xì)胞核表達(dá)數(shù)量增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與醛固酮組相比，依普利酮或補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清干預(yù)后NR3C2的細(xì)胞核表達(dá)數(shù)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見Fig 2。Western blot檢測顯示SGK-1、NF-кB(p65)表達(dá)：與Cont組比較，Ald組SGK-1、NF-кB(p65)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(SGK-1：P<0.01；NF-кB：P<0.05)；EPL組、TCM組與Ald組比較，SGK-1、NF-кB(p65)蛋白表達(dá)變?nèi)?見Fig 3。以上結(jié)果表明依普利酮或補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清抑制了HK2細(xì)胞MR的活化。

Fig 2 Protein expression of NR3C2 in HK2 cells by **P<0.01 vs Cont,##P<0.01 vs Ald

2.3 免疫熒光及Western blot檢測HK2細(xì)胞NLRP3、caspase-1和IL-1β表達(dá)免疫熒光顯示：NLRP3、caspase-1和IL-1β均呈綠色熒光表達(dá)于胞質(zhì)。Ald組與Cont組比較，三種蛋白表達(dá)增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；依普利酮或補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清干預(yù)后比Ald組表達(dá)減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot檢測：以上三種蛋白定量結(jié)果與免疫熒光結(jié)果具有一致性。與Cont比較，Ald組三種蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(NLRP3、caspase-1：P<0.01；IL-1β：P<0.05)；與Ald組比較，EPL組和TCM組中三種蛋白表達(dá)明顯減低(NLRP3、caspase-1：P<0.01；IL-1β：P<0.05)，見Fig 4。以上結(jié)果說明依普利酮或補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清對(duì)于醛固酮誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞焦亡具有抑制作用。

Fig 3 Protein expression of SGK-1 and NF-κB in HK2 cells by Western *P<0.05,**P<0.01 vs Cont,#P<0.05,##P<0.01 vs Ald.

Fig 4 Protein expression of NLRP3,caspase-1 and IL-1β in HK2 cells by Western blot or immunofluorescence *P<0.05,**P<0.01 vs Cont;#P<0.05,##P<0.01 vs Ald.

3 討論

焦亡屬于基因可調(diào)控的細(xì)胞死亡方式之一，與凋亡最大不同在于產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥損傷。故近年來焦亡在各器官病理損傷中頗受重視。有報(bào)道稱腎臟中巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞可通過NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)焦亡，而固有細(xì)胞一般則不發(fā)生焦亡，于艷等[4]研究發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下也可出現(xiàn)焦亡。炎癥損傷貫穿梗阻性腎病始終，而焦亡能引起劇烈炎癥反應(yīng)，所以由梗阻因素備受累及的腎小管上皮細(xì)胞是否發(fā)生焦亡，進(jìn)而促進(jìn)梗阻性腎病的發(fā)生、發(fā)展值得關(guān)注。焦亡檢測需要關(guān)注兩方面：首先，TUNEL檢測DNA損傷以證明細(xì)胞死亡，但不能分辨此種死亡屬于焦亡還是凋亡；其次，檢測焦亡依賴的信號(hào)通路，以鑒別凋亡。NLRP3炎癥小體在CKD中關(guān)注度最高，也是觸發(fā)焦亡的炎癥體之一。NF-κB與相應(yīng)基因結(jié)合后促進(jìn)NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β等分子轉(zhuǎn)錄、翻譯。隨后，當(dāng)NLRP3蛋白感知到體內(nèi)存在損傷或病原相關(guān)分子模式時(shí)(DAMP、PAMP)，迅速與接頭蛋白(ASC)和pro-caspase-1組裝，形成激活的NLRP3炎癥體。接下來NLRP3炎癥體級(jí)聯(lián)水解pro-caspase-1和pro-IL-1β[5]。NLRP3/caspase-1/IL-1β為檢測焦亡的經(jīng)典信號(hào)通路。近幾年研究發(fā)現(xiàn)Gasdermin家族中GSDMD蛋白被caspase激活后參與焦亡細(xì)胞膜孔的形成，炎癥因子可通過細(xì)胞膜孔溢出誘發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。此實(shí)驗(yàn)通過TUNEL和NLRP3/caspase-1/IL-1β信號(hào)通路聯(lián)合檢測發(fā)現(xiàn)醛固酮誘導(dǎo)的HK2出現(xiàn)細(xì)胞焦亡。加之前期實(shí)驗(yàn)觀察到腎小球系膜細(xì)胞同樣出現(xiàn)了焦亡[7]，故推測醛固酮可以誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞出現(xiàn)焦亡，給腎臟帶來炎癥損傷。

醛固酮及其鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocoricoid receptor,MR)誘導(dǎo)的炎癥損傷，參與梗阻性腎病的發(fā)生、發(fā)展。據(jù)報(bào)道高濃度血漿醛固酮可造成腎功能下降、蛋白尿，在UUO模型大鼠可導(dǎo)致腎小球硬化、足細(xì)胞損傷、腎組織中巨噬細(xì)胞增多，NLRP3、caspase-1、IL-18等炎癥因子高表達(dá)[8]，而鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑(MRB)可抑制腎組織炎性損傷。MR分布廣泛，除腎小管外還分布于心血管內(nèi)皮細(xì)胞等多個(gè)部位，是醛固酮誘導(dǎo)炎癥損傷的關(guān)鍵受體。MR屬于胞質(zhì)受體，當(dāng)與醛固酮結(jié)合后被激活進(jìn)入細(xì)胞核，觸發(fā)某些蛋白的基因轉(zhuǎn)錄[9]。SGK-1/NF-кB是醛固酮/MR下游的重要信號(hào)通路，MR活化促進(jìn)SGK-1、NF-кB蛋白高表達(dá)，從而介導(dǎo)多種炎癥分子產(chǎn)生，如NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β等[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中TUNEL、NR3C2、SGK-1、NF-кB及焦亡相關(guān)蛋白檢測結(jié)果表明：高選擇性的MRB─依普利酮對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞焦亡起到了明顯抑制作用，結(jié)合之前研究發(fā)現(xiàn)MRB對(duì)于醛固酮介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷及系膜細(xì)胞焦亡的抑制作用[12]，可證明MRB是抑制醛固酮/MR誘導(dǎo)的腎臟固有細(xì)胞損傷的良好選擇。

梗阻性腎病如早期無明顯臨床癥狀，加之腎臟本身代償功能強(qiáng)大，早期發(fā)現(xiàn)困難。部分病人即使早期解除梗阻，腎臟損傷仍會(huì)持續(xù)進(jìn)展甚至發(fā)展為腎衰竭[13]。中醫(yī)治療慢性腎病具有一定優(yōu)勢。慢性腎病以腎間質(zhì)纖維化為特征，可歸于中醫(yī)的“關(guān)格”、“水腫”等病癥范疇，其基本病機(jī)為脾腎虧虛、毒瘀互結(jié)、腎絡(luò)瘀阻。虛為此病之本，以脾腎為主。脾虛無以運(yùn)化水濕、化生氣血，腎虛分清泌濁功能失常，致氣血不足、水濕內(nèi)停，體內(nèi)病理產(chǎn)物郁積日久化毒，氣虛、水停、毒邪均可致瘀，阻于腎絡(luò)[14]。梗阻性腎病時(shí)腎臟血流瘀滯，多種炎癥因子浸潤，日久腎間質(zhì)膠原沉積及纖維化，故補(bǔ)益脾腎、活血通絡(luò)、化瘀解毒為其基本治法[15]。此實(shí)驗(yàn)以上述治法為指導(dǎo)確立“補(bǔ)氣活血解毒方”，方藥組成有黃芪、赤芍、地龍、醋鱉甲、黃芩、金銀花，諸藥配伍具有補(bǔ)氣、活血化瘀、解毒通絡(luò)之功效。臨床應(yīng)用顯示此方有助于減輕尿蛋白、改善腎臟功能，但其分子蛋白水平的作用機(jī)制需要多方面研究。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)活血解毒中藥可以下調(diào)8-OhdG 表達(dá)抑制梗阻性腎病大鼠細(xì)胞凋亡[16]，本次實(shí)驗(yàn)顯示補(bǔ)氣活血解毒方含藥血清減輕醛固酮誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，其作用機(jī)制與抑制NR3C2有關(guān)。

綜上，該實(shí)驗(yàn)從醛固酮誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞焦亡角度探討了梗阻性腎病的發(fā)病機(jī)制，為補(bǔ)氣活血解毒方通過減輕腎臟炎性損傷和腎臟固有細(xì)胞損失，治療梗阻性腎病提供了實(shí)驗(yàn)支持。

(致謝：衷心感謝河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供科研平臺(tái)!)