李紹林，段 啟，趙珍東，沈小鐘，夏 黎，潘穎珊

β-細(xì)辛醚脂質(zhì)立方液晶納米粒的Bottom-up法制備工藝優(yōu)化及處方篩選

李紹林，段 啟*，趙珍東，沈小鐘，夏 黎，潘穎珊

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520

以β-細(xì)辛醚為模型藥物，制備β-細(xì)辛醚脂質(zhì)立方液晶納米粒（β-asarone lipid cubic liquid crystal nanoparticles，β-A@LCNPs）載藥系統(tǒng)。采用Bottom-up法，以β-A@LCNPs的包封率、載藥量、穩(wěn)定性常數(shù)的歸一化綜合評分為質(zhì)量考察指標(biāo)，分別通過單因素考察立方液晶制備工藝，優(yōu)化工藝參數(shù)，并通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法，優(yōu)選β-A@LCNPs最佳處方。優(yōu)選的β-A@LCNPs制備工藝參數(shù)為60 ℃條件下，配置β-A@LCNPs懸濁液，而后1000 r/min勻速攪拌1.5 h，最后置于細(xì)胞超聲儀，200 W超聲15次，每次5 s，間隔10 s；優(yōu)選的β-A@LCNPs處方為單油酸甘油酯300 mg、β-細(xì)辛醚20 mg、聚乙烯醇27000 25 mg、水40 mL。β-A@LCNPs制備工藝簡單易行，重復(fù)性好；所得β-A@LCNPs立方結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，均一穩(wěn)定。

β-細(xì)辛醚；脂質(zhì)立方液晶；響應(yīng)面法；納米粒；Bottom-up法；包封率；載藥量；穩(wěn)定性常數(shù)

立方液晶納米粒（cubic liquid crystalline nanoparticles，LCNPs），又稱脂質(zhì)立方液晶納米?；蚣{米立方體，是兩親性脂質(zhì)和表面活性劑在水中自發(fā)形成的雙連續(xù)的立方液晶納米分散體系，即脂質(zhì)和表面活性劑結(jié)合水形成立方液晶相[1-2]，再以類似固體納米粒的形式分散在過量的水中形成分散體系，是一種新型納米載藥系統(tǒng)，其中水溶性藥物可以包封在類脂立方液晶的水道中，脂溶性的藥物包封在脂質(zhì)雙分子層中，兩親性分子可貫穿其中[3-4]。立方液晶介于層狀液晶、六角液晶之間的一種相態(tài)，具有更好的熱力學(xué)穩(wěn)定性、生物黏附性、生物可降解性、多樣性包載藥物能力等特點(diǎn)[5]，作為新型納米載藥系統(tǒng)在化學(xué)藥、生物藥、中藥領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用研究，已成為國內(nèi)外制劑研究的熱點(diǎn)之一[6-8]。

LCNPs制備方法有Top-down法、Bottom-up法、熱處理法、注入法、噴霧干燥法等。上述方法中，Bottom-up法是目前制備LCNPs常用的方法[9]。Bottom-up法是將脂質(zhì)材料和穩(wěn)定劑溶于有機(jī)溶劑中得到有機(jī)相，然后將有機(jī)相緩慢滴加到過量水相中，在攪拌、超聲等外界機(jī)械力分散作用下即可形成納米級粒子[10]。Bottom-up法更容易在較小能量輸出條件下產(chǎn)生粒子均勻、粒徑較小的LCNPs。Bottom-up法制備納米粒過程中因穩(wěn)定劑加入，納米粒分散體有較好的穩(wěn)定性[11-12]。

β-細(xì)辛醚為天南星科菖蒲屬植物石菖蒲Schott有效成分，藥理研究表明β-細(xì)辛醚藥理作用廣泛，具有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)心血管、抗哮喘、抗腫瘤、驅(qū)蟲等功效，具有極大的臨床運(yùn)用價(jià)值[13-14]，但β-細(xì)辛醚水溶性差，不穩(wěn)定，且體內(nèi)吸收、代謝速度極快，藥物濃度起伏大，難以維持足夠長的有效血藥濃度，生物利用度低，制約了藥物的臨床應(yīng)用[15]。采用新劑型改進(jìn)藥物，是解決藥物存在問題的有效方法。本實(shí)驗(yàn)選取β-細(xì)辛醚為模型藥物，采用Bottom-up法優(yōu)化β-細(xì)辛醚脂質(zhì)立方液晶納米粒（β-asarone lipid cubic liquid crystal nanoparticles，β-A@LCNPs）的制備工藝，并通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法篩選β-A@LCNPs處方。

1 儀器與試藥

丹東百特BT-90納米激光粒度儀，丹東百特儀器有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括四元泵洗脫系統(tǒng)、自動進(jìn)樣器、在線脫氣裝置、柱溫箱及光電二極管矩陣檢測器，美國Agilent公司；VORTEX 4渦旋振蕩器，上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器公司；G220透射電子顯微鏡（TEM），荷蘭FEI公司；TG16.5離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)公司；KQ-50TDB高頻數(shù)控超聲儀，昆山超聲儀器公司；TK-12B型透皮擴(kuò)散儀，上海凱鍇科貿(mào)有限公司。

β-細(xì)辛醚對照品，廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院自制，HPLC峰面積歸一化法測得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.21%；石菖蒲，批號201909160810，購自廣州致信藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院梁永樞副主任中藥師鑒定為天南星科菖蒲屬植物石菖蒲Schott的干燥根莖；聚氧乙烯蓖麻油（cremephor EL，CEL）、泊洛沙姆407（polyethylene-polypropylene glycol，F(xiàn)127）、單油酸甘油酯（glyceryl monoolein，GMO），德國BASF公司；聚乙烯醇15000（polyvinyl alcohol，PVA150）、聚乙烯醇27000（PVA）、烷基酚聚氧乙烯醚（OP10乳化劑），上海麥克林生化科技有限公司；液相用甲醇、乙腈、乙醇為色譜純；聚乙二醇200（PEG200）、PEG400、異丙醇、丙二醇、丙三醇、去氧膽酸鈉、無水乙醇均為分析純，購于廣州化學(xué)試劑廠；水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 β-A@LCNPs的制備

采用Bottom-up法制備β-A@LCNPs，精密稱取適量GMO于50 mL燒杯中，取處方量β-細(xì)辛醚滴加無水乙醇至完全溶解，倒入上述燒杯中混勻，水浴至60 ℃，作為A相；精密稱取適量PVA于100 mL燒杯中，加入適量蒸餾水，水浴至60 ℃，使PVA完全溶解，作為B相；將A相緩慢倒入B相中，60 ℃恒溫條件下，以800 r/min磁粒攪拌1.5 h，再于細(xì)胞超聲破碎儀上超聲5 min（超聲功率為150 W，5 s/次，每次間隔5 s），即得β-A@LCNPs。

2.2 β-細(xì)辛醚的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（65∶35）；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測波長253 nm；進(jìn)樣量10 μL；理論塔板數(shù)以β-細(xì)辛醚計(jì)不少于3400。色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取β-細(xì)辛醚對照品適量，至棕色量瓶中，加甲醇定容，制成β-細(xì)辛醚濃度為32.27 μg/mL的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 精密吸取β-A@LCNPs懸濁液樣品1 mL至10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

圖1 β-細(xì)辛醚對照品(A)、β-A@LCNPs樣品(B)的HPLC圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取β-細(xì)辛醚對照品溶液1、2、4、6、8 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，備用。精密吸取上述對照品溶液各10 μL，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測定峰面積，以峰面積（）對進(jìn)樣量（）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程＝72 859.93－560.6，＝0.999 99，結(jié)果表明β-細(xì)辛醚在32.27～258.16 ng，峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果β-細(xì)辛醚峰面積的RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于制備后0、0.5、1.0、3.0、6.0、12.0 h精密吸取10 μL供試品溶液進(jìn)樣測定，結(jié)果β-細(xì)辛醚峰面積的RSD為1.23%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)測定穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取6份β-A@LCNPs懸濁液樣品，照“2.2.3”項(xiàng)方法制得6份供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定，結(jié)果β-細(xì)辛醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取1 mL已測定β-細(xì)辛醚含量的β-A@LCNPs懸濁液至10 mL棕色量瓶中，共6份，分別加入2 mL已知質(zhì)量濃度的對照品溶液，照“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測定β-細(xì)辛醚含量，計(jì)算回收率，結(jié)果β-細(xì)辛醚的平均加樣回收率為99.81%，RSD為0.75%，表明本方法β-細(xì)辛醚具有較好的加樣回收率。

2.2.9 樣品定量測定 按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品進(jìn)樣液，依照“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測定β-細(xì)辛醚峰面積，代入線性方程，計(jì)算出樣品中β-細(xì)辛醚的含量。

2.3 β-A@LCNPs質(zhì)量考察指標(biāo)測定

2.3.1 β-A@LCNPs包封率及載藥量的測定 稱取一定量β-細(xì)辛醚（td），按“2.1”項(xiàng)方法制備得β-A@LCNPs溶液，將β-A@LCNPs溶液采用高速離心法，13 485×離心10 min，分離得到上清液和β-A@LCNPs沉淀。吸取上清液，按照“2.2.1”項(xiàng)色譜條件檢測分析上清液中游離的β-細(xì)辛醚含量，測定游離β-細(xì)辛醚質(zhì)量（fd）；取下層沉淀，采用冷凍干燥法將其干燥得β-A@LCNPs，并精密稱定，得納米粒總質(zhì)量（LCNPs）。根據(jù)公式（1）、（2）分別計(jì)算β-A@LCNPs包封率和載藥量。

包封率＝(td－fd)/td（1）

載藥量＝(td－fd)/LCNPs（2）

2.3.2 穩(wěn)定性常數(shù)（e）的測定 采用離心-可見光分光光度法測定β-A@LCNPs的e。具體測定方法為量取β-A@LCNPs，檢測波長450 nm，采用可見光分光光度法測定其濁度為0；900×離心30 min，吸取上層液，可見光分光光度法同波長測定離心后上層液的濁度為，根據(jù)公式（3）計(jì)算e。

e＝(0－)/0（3）

2.3.3 歸一化總評值（）計(jì)算[16]綜合考量β-A@LCNPs的包封率、載藥量及e值，作為制劑質(zhì)量評價(jià)因素，因而采用Derringer’s法將包封率、載藥量和e轉(zhuǎn)換為值。根據(jù)Hassan法分別求Partial期望值（d），其中包封率及載藥量值越大，表示β-A@LCNPs質(zhì)量越好，而e值越小，則說明β-A@LCNPs質(zhì)量越好，根據(jù)公式（4）分別將包封率及載藥量歸一化為Partial期望值，記為1、2；根據(jù)公式（5）將e歸一化為Partial期望值，記為3，再根據(jù)公式（6）將1、2、3轉(zhuǎn)化為值。

d＝(x－)/(－) （4）

d＝(－x)/(－) （5）

＝(123)1/3（6）

為響應(yīng)值中的最小值，為響應(yīng)值中的最大值，d為每個(gè)因素Partial期望值，x為參數(shù)實(shí)測值

2.4 單因素法考察β-A@LCNPs制備工藝及處方

經(jīng)前期預(yù)試驗(yàn)，采用Bottom-up法制備β-A@ LCNPs，以載藥量、包封率及e的值為β-A@ LCNPs質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)，保持其他條件等同，考察單個(gè)因素變化對值的影響，初選工藝及處方。

2.4.1 攪拌時(shí)間考察 采用Bottom-up法制備β-A@LCNPs，取β-細(xì)辛醚20 mg滴加無水乙醇至完全溶解，加入裝有0.20 g GMO的燒杯中，水浴至60 ℃，作為A相；稱取20 mg PVA加入裝有40 mL蒸餾水中水浴至60 ℃，使PVA完全溶解，作為B相；將A相緩慢倒入B相中，重復(fù)上述操作，平行制備5份樣品，備用；60 ℃恒溫條件下，以1000 r/min勻速攪拌，分別攪拌0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，考察不同攪拌時(shí)間對制備β-A@LCNPs值的影響。測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計(jì)算值，結(jié)果見表1?？芍瑪嚢钑r(shí)間在1.5 h內(nèi)，隨著攪拌時(shí)間增長，β-A@LCNPs的值增加，當(dāng)攪拌時(shí)間超過1.5 h，β-A@LCNPs的值反而呈下降趨勢，這可能由于攪拌時(shí)間過長，攪拌剪切力破壞已形成納米粒的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，致使藥物溶出，載藥量及包封率下降，因此，選擇攪拌時(shí)間1.5 h。

表1 攪拌時(shí)間對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

2.4.2 攪拌速率考察 參照“2.3.1”項(xiàng)方法平行配置5份β-A@LCNPs懸濁液，60 ℃恒溫條件下，分別以500、800、1000、1200、1500 r/min不同攪拌速度，攪拌1.5 h，考察不同攪拌速度對制備β-A@LCNPs值的影響。測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計(jì)算值，結(jié)果見表2?？芍瑪嚢杷俣仍?000 r/min內(nèi)，隨著攪拌速度增加，β-A@LCNPs的值增加，當(dāng)攪拌速度超過1000 r/min時(shí)，β-A@LCNPs的值反而呈下降趨勢，這可能由于攪拌速度小，納米粒子不容易分散開，易沉；而速度過快，納米粒子間碰撞加劇，粒子聚集而析出，值較小，因此，選擇攪拌速度1000 r/min。

表2 攪拌速率對包封率、載藥量、Ke、D值的影響

2.4.3 超聲功率考察 參照“2.3.1”項(xiàng)方法平行配置5份β-A@LCNPs懸濁液，60 ℃恒溫條件下，1000 r/min轉(zhuǎn)速，勻速攪拌1.5 h，而后分別置于細(xì)胞超聲儀，分別以100、150、200、250、300 W超聲處理10次，每次5 s，間隔10 s，測定各樣品包封率、載藥量、e，并計(jì)算值，結(jié)果見表3?？芍?，超聲功率對樣品的值影響較大，當(dāng)超聲功率＞200 W時(shí)，隨著超聲功率的增加，包封率及載藥量下降，值減小，這可能由于超聲功率過大對納米粒子結(jié)構(gòu)造成破壞，因而確定超聲功率為200 W。

表3 超聲功率對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

2.4.4 超聲次數(shù)考察 參照“2.3.1”項(xiàng)方法平行配置5份β-A@LCNPs懸濁液，60 ℃恒溫條件下，1000 r/min轉(zhuǎn)速，勻速攪拌1.5 h，而后分別置于細(xì)胞超聲儀，設(shè)定超聲功率為200 W，分別超聲5、10、15、20、25次，每次5 s，間隔10 s，測定各樣品包封率、載藥量、e，并計(jì)算值，結(jié)果見表4。可知，當(dāng)超聲次數(shù)超過15次時(shí)，β-A@LCNPs的值減小，說明超聲次數(shù)過多導(dǎo)致晶型發(fā)生改變，藥物滲漏，包封率下降，載藥量下降。所以，綜合考慮選擇超聲次數(shù)為15次。

表4 超聲次數(shù)對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

2.4.5 GMO用量考察 參照“2.3.1”項(xiàng)方法平行配置GMO量分別為0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g，其余各量等同（PVA 20 mg、β-細(xì)辛醚20 mg、水40 mL）β-A@LCNPs懸濁液，60 ℃恒溫條件下，1000 r/min轉(zhuǎn)速，勻速攪拌1.5 h，而后置細(xì)胞超聲儀，200 W，超聲15次，每次5 s，間隔10 s，測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計(jì)算值，結(jié)果見表5?？芍珿MO加入量對該載藥系統(tǒng)的值具有明顯影響，當(dāng)GMO用量為0.25 g時(shí)，值最大，這與GMO用量對納米粒子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有關(guān)，需進(jìn)一步優(yōu)選用量。

2.4.6 投藥量考察 保持其他條件等同（GMO 0.25 g、PVA 20 mg、水40 mL），分別配置不同投藥量（10、15、20、25、30 mg），同等制備工藝（參照“2.3.5”項(xiàng)），制備β-A@LCNPs，分別測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計(jì)算值，結(jié)果見表6?？芍?，投藥量＜20 mg，隨著投藥量增加值增大，當(dāng)投藥量＞20 mg，隨著投藥量增加值減小，說明投藥量對β-A@LCNPs制備的值有較大影響，需做進(jìn)一步考察優(yōu)化。

表5 GMO用量對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

表6 投藥量對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

2.4.7 穩(wěn)定劑種類篩選 保持其它條件等同（GMO 0.25 g、β-細(xì)辛醚20 mg、水40 mL），分別稱取你20 mg不同穩(wěn)定劑（F127、PVA150、PVA），同等制備工藝（參照“2.3.5”項(xiàng)），制備β-A@LCNPs，分別測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計(jì)算值，結(jié)果見表7?？芍琍VA作穩(wěn)定劑時(shí)，包封率、載藥量、e及值最大，故選擇PVA作為β-細(xì)辛醚LCNPs載藥系統(tǒng)穩(wěn)定劑。

2.4.8 穩(wěn)定劑PVA用量考察 保持其他條件等同（GMO 0.25 g、β-細(xì)辛醚20 mg、水40 mL），分別稱取不同劑量PVA（10、15、20、25、30 mg），同等制備工藝（參照“2.3.5”項(xiàng)），制備β-A@LCNPs，分別測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計(jì)算值，結(jié)果見表8?？芍端幜浚?0 mg，隨著投藥量增加值增大，當(dāng)投藥量＞20 mg，隨著投藥量增加值減小，說明說明PVA在一定范圍內(nèi)可以參與脂質(zhì)立方液晶結(jié)構(gòu)的組裝并能支撐整個(gè)骨架，但是當(dāng)用量超過20 mg，其又可能會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的破壞或者晶型結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致包封率、載藥量、e及值下降，需做進(jìn)一步考察優(yōu)化。

表7 不同穩(wěn)定劑對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

表8 PVA用量對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

2.4.9 分散相水量考察 保持其它條件等同（GMO 0.25 g、PVA 20 mg、β-細(xì)辛醚20 mg），分別量取不同體積分散水相（20、30、40、50、60 mL），同等制備工藝（參照“2.3.5”項(xiàng)），制備β-A@LCNPs，分別測定各樣品包封率、載藥量、e值，并計(jì)算值，結(jié)果見表9?？芍S著水相體積增加，該遞釋系統(tǒng)值增加，當(dāng)水相體積＞30 mL時(shí)，值幾乎不變。原因可能當(dāng)水含量少，β-A@LCNPs的濃度大，納米粒易相互黏合，藥物易析出；水相體積大，納米粒能較好的分散，不聚集，載藥量、包封率較高，e較小，值變大。考慮該載藥系統(tǒng)的藥物濃度，需對水相用量進(jìn)一步優(yōu)選。

2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化β-A@LCNPs處方

通過單因素法考察發(fā)現(xiàn)GMO量、β-細(xì)辛醚量、PVA量及水相對β-A@LCNPs質(zhì)量綜合評分影響較大，并采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法對β-A@LCNPs處方進(jìn)一步優(yōu)化。

表9 分散相水量對包封率、載藥量、Ke和D值的影響

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取GMO量（1）、β-細(xì)辛醚量（2）、PVA量（3）、水相（4）4個(gè)因素作為自變量，每個(gè)因素設(shè)5水平，用代碼值?、?1、0、+1、+來表示（4因素星點(diǎn)設(shè)計(jì)的＝1.682）。代碼值所代表的實(shí)際操作物理量見因素水平表10。分別測定各試驗(yàn)樣品的包封率、載藥量和e，參照“2.2.3”項(xiàng)下方法，計(jì)算值，作為β-A@LCNPs綜合評價(jià)考察指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化處方，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表10。

表10 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排及結(jié)果

2.5.2 模型擬合 將所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析[17]，以各考察指標(biāo)的值為響應(yīng)值，對各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合。多元線性回歸方程＝0.71－0.009 51－0.032－0.0433＋0.007 74，＝0.245 1，＞0.05；二項(xiàng)式擬合方程＝0.0121－0.0072－0.0433＋0.0234＋0.02612＋0.09413＋0.03814＋0.02323－0.01824－0.0234－0.002 812＋0.008 722－0.02632－0.08842，＝0.997 5，＜0.01。

從擬合方程的相關(guān)系數(shù)可見，多元線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)較低，表示自變量與因變量之間線性相關(guān)性較差，可見多元線性回歸擬合度不佳，預(yù)測性較差，因此該數(shù)學(xué)模型不合適。而多元二項(xiàng)式擬合方程相關(guān)系數(shù)較高，擬合效果較好。其中，1、2、3、4、12、22、32及42項(xiàng)為4因素對指標(biāo)的單獨(dú)作用，而12、23、13、24、14和34項(xiàng)為因素的交互作用，方程從整體上反映了各因素及其相互作用對指標(biāo)值的影響。

2.5.3 方差分析 采用ANOVA分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)。表11中統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)顯示給出了線性項(xiàng)、二次項(xiàng)、以及交互項(xiàng)對各考察指標(biāo)綜合得分的影響，其中GMO量（1）、PVA量（3），對響應(yīng)值（綜合評分值）的曲面效應(yīng)顯著（＜0.05）；GMO量（1）與PVA量（3）的交互項(xiàng)（13）、水量的二次項(xiàng)（42）對響應(yīng)值（值）的曲面效應(yīng)極顯著（＜0.01）；在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對響應(yīng)值（值）的影響排序：PVA量（3）＞GMO量（1）＞水（4）＞β-細(xì)辛醚（2）。二項(xiàng)式回歸方程失擬檢驗(yàn)不顯著，說明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。擬合檢驗(yàn)極顯著，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，較好地反應(yīng)了β-A@LCNPs綜合得分（值）與GMO、β-細(xì)辛醚、PVA、水不同配方用量的關(guān)系，可以對條件范圍內(nèi)不同配方的β-A@LCNPs進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)（綜合評分值）進(jìn)行預(yù)測。

表11 響應(yīng)面二次模型的方差分析結(jié)果

2.5.4 響應(yīng)面優(yōu)化、預(yù)測與驗(yàn)證 根據(jù)二次多項(xiàng)式模型，應(yīng)用Design-Expert 8.0.5b軟件繪制各考察指標(biāo)綜合得分與各自變量間的三維響應(yīng)曲面圖及等高線圖，結(jié)果見圖2。

結(jié)合二次回歸模型進(jìn)行預(yù)測分析，β-A@LCNPs值最大值為0.745 5，此時(shí)最優(yōu)處方GMO 300 mg、β-細(xì)辛醚20 mg、PVA 25 mg、水40 mL。

圖2 各因素間對β-A@LCNPs D值的影響

按最優(yōu)處方，配制3份β-A@LCNPs，對每份樣品進(jìn)行質(zhì)量綜合評價(jià)得分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果β-A@LCNPs包封率平均值為90.78%、載藥量平均值為5.31%、e平均值為7.21%，值平均為0.72，實(shí)際值與預(yù)測值相比偏差率為?2.91%，RSD為1.36%，表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，所選處方重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定。

2.6 β-A@LCNPs粒徑分布測試

按β-A@LCNPs最優(yōu)處方及工藝平行制備3份樣品，用蒸餾水稀釋10倍，分別測定其粒徑分布，結(jié)果顯示，β-A@LCNPs粒徑分布成正態(tài)分布，平均粒徑為（85.28±3.26）nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.190±0.003。

2.7 β-A@LCNPs TEM觀察

按β-A@LCNPs最優(yōu)處方及工藝制備β-A@ LCNPs樣品，稀釋100倍，滴在樣品臺上，放置于干燥皿中自然干燥。樣品干燥后放入離子濺射儀中鍍金膜，再將樣品置于透射電鏡中觀察[18]，結(jié)果見圖3。由圖3可見，β-A@LCNPs在水中分散較好，且粒徑大小差異較小。通過放大電鏡倍數(shù)發(fā)現(xiàn)，β-A@LCNPs為立方體結(jié)構(gòu)，外觀完整，且存在空間結(jié)構(gòu)堆積。

圖3 β-A@LCNPs的TEM圖

2.8 體外經(jīng)皮滲透考察

分別配制相同藥物濃度（載藥量5.31%）的β-A@LCNPs（按最優(yōu)處方與制備工藝制備）與β-細(xì)辛醚乳液（精密稱取20 mg β-細(xì)辛醚，滴加無水乙醇至完全溶解，再加入10 mL聚氧乙烯蓖麻油，攪拌均勻，而后逐滴加入30 mL蒸餾水，邊滴邊攪拌均勻，即得[19]）進(jìn)行體外經(jīng)皮滲透考察。

取β-A@LCNPs和β-細(xì)辛醚乳液各5 mL，分別加入Franz擴(kuò)散池[20]，滲透膜為小鼠腹部脫毛全皮，所用鼠皮的厚度均一，有效擴(kuò)散面積為4.50 cm2，接收池體積為18 mL，接收介質(zhì)為32 ℃生理鹽水，200 r/min勻速磁力攪拌，以β-細(xì)辛醚為考察指標(biāo)，分別于1、2、4、6、8、10、12 h抽取5 mL接收液（同時(shí)補(bǔ)加5 mL空白接收液），過0.45 μm微孔，參照“2.2.1”項(xiàng)下方法，測定接收液中β-細(xì)辛醚含量，以上試驗(yàn)，β-A@LCNPs和普通乳分別平行做3組試驗(yàn)，取均值，繪制滲透曲線，擬合參數(shù)，得藥物體外經(jīng)皮滲透動力學(xué)曲線方程見表12，通過比較體外經(jīng)皮滲透動力學(xué)參數(shù)穩(wěn)態(tài)透皮速率（s）和單位面積累積滲透量（Q），可以看出β-A@LCNPs較β-細(xì)辛醚乳液透皮速率提升了3倍，制劑透皮性能得到顯著提升。

Q＝C/

s＝d/d

C＝C＋0/ps

C為時(shí)間藥物的校正質(zhì)量濃度，C為時(shí)間藥物的測定質(zhì)量濃度，ps為時(shí)前藥物的測定質(zhì)量濃度，0為每次取樣體積，為接收液的總體積，Q為時(shí)間單位面積累積滲透量，為有效擴(kuò)散面積

3 討論

本研究采用Bottom-up法將模型藥物β-細(xì)辛醚制備為LCNPs載藥體系，通過單因素方法分別考察攪拌時(shí)間、攪拌速率、超聲功率、超聲次數(shù)、對β-A@LCNPs制備工藝進(jìn)行考察優(yōu)化，確立最佳制備工藝。并在單因素考察處方劑量對β-A@LCNPs質(zhì)量影響的基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法，以β-A@LCNPs各組分為考察因素，結(jié)合Design-Expert 4因素5水平設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)，以β-A@LCNPs質(zhì)量綜合評分（值）為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選出最佳β-A@LCNPs處方，優(yōu)選的β-A@LCNPs制備工藝、處方穩(wěn)定可行。

表12 β-A@LCNPs與β-細(xì)辛醚乳液體外經(jīng)皮滲透動力學(xué)參數(shù)(n = 3)

目前國內(nèi)多采用繪制三元相圖液晶區(qū)篩選立方液晶處方，但往往存在可選擇區(qū)域范圍廣，考察指標(biāo)相對主觀，最終確立的處方多是預(yù)設(shè)的考察參數(shù)優(yōu)選，無法動態(tài)連續(xù)篩選指標(biāo)，精確度不高。本實(shí)驗(yàn)LCNPs最佳處方篩選，在單因素考察指標(biāo)參數(shù)范圍的基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法，各因素對效應(yīng)的影響并非線性，且考慮到多因素間的交互作用，區(qū)別于線性設(shè)計(jì)的正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)篩選處方，星點(diǎn)設(shè)計(jì)通過多次試驗(yàn)結(jié)果參數(shù)進(jìn)行模型擬合優(yōu)化，找到擬合度最佳方程，指標(biāo)參數(shù)具有連續(xù)性，多元高次方程綜合考量單因素及因素間的協(xié)同效應(yīng)，推算出最佳配方，驗(yàn)證及重復(fù)性好，工藝穩(wěn)定。星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法篩選立方液晶處方，預(yù)測指導(dǎo)性更強(qiáng)，具有較好的推廣應(yīng)用價(jià)值，為β-A@LCNPs制備工藝提供了科學(xué)、合理的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

立方液晶載藥系統(tǒng)制備方法有熱融法、噴霧干燥法、Top-down法、Bottom-up法，其中熱融法、噴霧干燥法所需溫度高，對溫度敏感性藥物不適宜[21]，Top-down法在制備過程需要更高能量，系統(tǒng)溫度高，納米粒在高溫條件下容易碰撞引起絮凝[3]，本文選用Bottom-up法加入有機(jī)溶劑有助β-細(xì)辛醚溶解，制備方法簡單，制備工藝穩(wěn)定可靠，制備的β-A@LCNPs質(zhì)量以包封率、載藥量、穩(wěn)定性為評價(jià)指標(biāo)的綜合評分高、質(zhì)量好。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Bottom-up preparation process optimization and prescription screening for β-asarone lipid cubic liquid crystal nanoparticles

LI Shao-lin, DUAN Qi, ZHAO Zhen-dong, SHEN Xiao-zhong, XIA Li, PAN Ying-shan

Guang Dong Food and Drug Vocational College, Guangzhou 510520, China

To prepare β-asarone lipid cubic liquid crystal nanoparticles (β-A@LCNPs) drug delivery system with β-asarone as model drug.The quality of β-A@LCNPs was evaluated by the normalized comprehensive score of encapsulation rate, drug loading capacity and stability constant. The preparation process of cubic liquid crystal was investigated by single factor, and the process parameters were optimized. The optimal formulation of β-A@LCNPs was optimized by response surface method of centroid design.The optimal preparation process parameters of β-A@LCNPs were as follows: Bottom-up method, 60 ℃, β-A@LCNPs suspension was prepared, then 1000 r/min uniform stirring for 1.5 h, finally placed in the cell ultrasound instrument, 200 watt ultrasonic power, ultrasonic 15 times, 5 s each time, 10 s interval; The optimal prescription for β-A@LCNPs was glycerin monoleate 300 mg, β-asarone 20 mg, polyvinyl alcohol 27000 25 mg and water 40 mL.The preparation process of β-A@LCNPs is simple, easy to perform and has good repeatability. The β-A@LCNPs were homogeneous and stable.

β-asarone; lipid cubic liquid crystal; response surface method; nanoparticles; Bottom-up method; encapsulation rate; drug loading capacity; stability constant

R283.6

A

0253 - 2670(2021)24 - 7464 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.008

2021-07-31

廣東省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2017GKQNCX037）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（202102080588）；廣東省醫(yī)學(xué)基金項(xiàng)目（B2021236）；廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目（20211280）

李紹林（1983—），男，博士，主要從事中藥新藥與新技術(shù)研究。Tel: (020)28854910 E-mail: lisl@gdyzy.edu.cn

段 啟（1969—），男，教授，主要從事中藥制劑與炮制研究。Tel: (020)28854910 E-mail: duanq@gdyzy.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]