鄭丹丹 張穎 劉曉紅 王江云

摘要 漆酶CueO是一種含有4個銅原子的多銅氧化酶，是一種環(huán)境友好型酶，可以參與木質(zhì)素的降解，并催化多種芳胺類小分子化合物的氧化。本文以E.coli BL21為表達菌株，優(yōu)化表達條件，證明CueO的基因可以在大腸桿菌中異源重組表達。通過鎳柱親和層析法和分子排阻層析法純化得到了目的蛋白，表達量為40 mg/L。采用電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜及銅配位顯色的方法計算了CueO中的銅嵌入率。最后，以CueO作為催化劑，釕（II）-三聯(lián)吡啶金屬配合物[Ru（bpy）3]2+作光敏劑，同時抗壞血酸鈉作為犧牲還原劑，在可見光照射15 h后，氣相色譜檢驗該體系可將CO2還原為CO，催化反應的轉(zhuǎn)換數(shù)（TON）值為192。該體系是以水為溶劑，避免了有機溶劑的使用。此外，通過對CueO進行點突變，還可以改變光催化CO2還原活性。

關(guān) 鍵 詞 光催化;二氧化碳還原;漆酶（CueO）;光敏劑;一氧化碳

中圖分類號 O644.1? ? ?文獻標志碼 A

Abstract Laccase， CueO， is a multicopper oxidase containing four copper atoms. It is an environmental- friendly enzyme that can participate in lignin degradation and catalyze the oxidation of many small aromatic amines. Using E. coli BL21 as an expression strain， it has proved that CueO gene can be expressed heterologously in E. coli by optimizing expression conditions. The target protein was purified by nickel-affinity chromatography and molecular exclusion chromatography with the expression yield of 40 mg/L. The copper atom embedding efficiency in CueO was calculated by ICP-MS and copper atom coordination color development. Finally， using CueO as catalyst， ruthenium（II）-dipyridine metal complex was used as photosensitizer and sodium ascorbate was used as sacrificial reductant. After 15 hours of visible light irradiation， the gas chromatography shows that the system can reduce CO2 to CO， and the turnover number （TON） of the catalytic reaction is 192. The system uses water as solvent and avoids the use of organic solvent. In addition， the photocatalytic CO2 reduction activity can be changed by point mutation of CueO.

Key words photocatalytic; CO2 reduction; laccase （CueO）; photosensitizer; CO

0 引言

工業(yè)革命之后，人類活動排放了大量CO2等溫室氣體，使得溫室效應不斷加劇[1]，并導致了冰川融化，極端氣候等環(huán)境問題。近年來，世界各國在減少CO2排放方面做出了許多努力，積極研發(fā)綠色可持續(xù)能源，同時科學研究者也致力于捕獲和回收利用CO2[2]。目前，利用可見光驅(qū)動的光化學反應產(chǎn)生可再生資源是解決能源和環(huán)境問題的一種潛在策略。

基于自然界光合作用的原理[3]設計的人工模擬光合作用系統(tǒng)可以有效地捕獲、儲存和利用CO2。可見光驅(qū)動的CO2還原反應系統(tǒng)一般主要包括光敏劑、電子供體和催化劑。而發(fā)展金屬配合物催化劑進行光催化還原CO2是太陽能燃料生產(chǎn)的重要前沿。最近，以Mn[4]，F(xiàn)e[5-10]，Co[11-14]，Ni[15-17]，Cu[18-26]等一系列過渡金屬為基礎的分子催化劑已經(jīng)被用來研究光催化CO2還原。這些催化劑可以將CO2還原成一氧化碳、甲醇、甲烷、甲酸、草酸等化工產(chǎn)品。例如，Guo等[24]報道的平面二配體銅復合物[Cu（qpy）]2+（qpy=2，2’：6’，2”：6”，2”’ -quaterpyridine）是可見光驅(qū)動CO2還原成CO的高效催化劑，該體系用[Ru（bpy）3]2+作為光敏劑，BIH/TEOA（1，3-dimethyl-2-phenyl-2，3-dihydro-1H-benzo [d]imidazole /triethano-lamine）作為犧牲電子供體，[Cu（qpy）]2+對含水乙腈溶液的可見光驅(qū)動CO2還原的催化活性TON和選擇性分別為12 400和97%。Liu等[27]開發(fā)了銅（II）復合物（Et4N）[Cu（pyN2Me2）（HCO2）]，其作為催化劑在可見光照射下顯示出高效的催化CO2還原活性，并有TON為9900和98%的高選擇性。這些研究讓人聯(lián)想到生物化學中的金屬酶。酶是天然生物催化劑，在溫和的條件下加速催化反應[28]。受此啟發(fā)，我們探索了含有4個銅結(jié)合位點的漆酶催化CO2還原的活性以及進化為CO2光還原酶的潛力。

基于以往銅復合物在可見光下可以固定CO2的報道，其銅原子的位點可以作為二氧化碳還原的催化位點，從而具有光催化轉(zhuǎn)化二氧化碳的潛力。本文選取可以結(jié)合多個銅原子的CueO作為催化劑，[Ru（bpy）3]2+作光敏劑同時抗壞血酸鈉作為犧牲還原劑。希望該體系能通過模擬天然光合作用系統(tǒng)吸收光能實現(xiàn)催化CO2還原的功能。這是首次嘗試用CueO做催化劑還原CO2。通過該酶與光敏劑，犧牲還原劑形成復合體系，本文研究了一種新型的基于多銅酶為催化劑的光催化還原CO2的高效催化反應。

1 實驗方法

1.1 試劑與儀器

硫酸銅（CuSO4）、氯化銅（CuCl2）、二硫代四乙基秋蘭姆（TETD）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、抗壞血酸鈉、釕（II）-二聯(lián)吡啶金屬配合物[Ru（bpy）3]2+、咪唑均為分析純，購于北京市百靈威科技有限公司。CO2和Ar（純度為99.999%）購于北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司。實驗用水為Milli-Q雙蒸水。

使用北京泊菲萊科技有限公司的PLS-SXE300D氙燈做為光源;使用寧波新芝生物科技有限公司的超聲儀器進行細胞破碎;使用上海天能科技有限公司的蛋白電泳儀;使用上海尤尼柯儀器有限公司的紫外可見分光光度計（UV-visible spectroscopy）進行定性和定量分析; 使用美國Thermo公司的電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜（ICP-MS）對樣品進行Cu的元素分析;使用美國SRI公司8610C氣相色譜儀（GC）進行氣體檢測。

1.2 蛋白構(gòu)建、表達和純化

本文所描述的蛋白及突變體用pet28a載體構(gòu)建。通過點突變，把CueO第500位的半胱氨酸殘基突變?yōu)槔i氨酸（CueOC500V）的引物設計為：（f） TGGCGCACGTTCATCTACTGGAGCATG;（r） CAGTAGATGAACGTGCGCCATATAAGC。

構(gòu)建好質(zhì)粒并測序成功后，在大腸桿菌細胞（E.coli BL21）中重組表達CueO。次日，挑取單克隆于100 mL含卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基中，放到37 ℃搖床200 r/min過夜。然后，將菌液按1∶100接入含有卡那霉素抗性100 mL LB培養(yǎng)基中，放到37 ℃搖床200 r/min培養(yǎng)。當大腸桿菌生長到OD約為0.8時加入終濃度為1 mmol/L IPTG，分別于20 ℃和30 ℃誘導12 h。在4 ℃，4 000 r/min下離心30 min收菌。裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8，150 mmol/L NaCl）中的細胞通過超聲裂解。超聲后的細胞離心，將上清液上樣到鎳柱親和層析柱（Ni-NTA柱）。用5 mL洗滌緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8，150 mmol/L NaCl和10 mmol/L咪唑）洗滌Ni-NTA柱2次，然后用洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8，150 mmol/L NaCl和250 mmol/L咪唑）洗脫目的蛋白。利用分子排阻層析（Superdex 75 10/300 GL; GE Healthcare）等方法進一步純化蛋白。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測所需蛋白純度和分子量，并用紫外可見吸收光譜對CueO進行定性和定量分析。為了提高CueO外源銅離子嵌入率，表達蛋白時額外添加1 mmol/L CuSO4或1 mmol/L CuCl2溶液以在CueO中引入更多銅離子。

1.3 CueO中銅含量的檢測

本實驗中利用電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜（ICP-MS）檢測蛋白中銅的含量。將定量后的樣品加入1.5 mL濃硝酸震蕩混勻，然后在180 ℃的電熱板上消解。溶液無明顯反映現(xiàn)象后，冷卻定容到10 mL即可上機測試。

實驗使用四乙基秋蘭姆-銅絡合物顯色的方法同樣檢測CueO中銅的含量[29]。首先，將0.4%二硫代四乙基秋蘭姆（TETD）溶解于丙酮與水體積比為4∶1的溶液里待用。配制含有0，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L和50 μmol/L CuSO4的溶液做為銅離子參照，然后用70%高氯酸進行消解。將上述樣品在100 ℃水浴中恒溫加熱3 min，離心后分別加入50 μL的0.4% TETD進行顯色反應。在3 h內(nèi)，用分光光度計記錄422 nm處讀出吸光值。用紫外可見吸收光譜記錄一系列不同銅離子濃度的吸光值并繪制標準曲線。每次定量CueO中銅離子含量都需要先繪制標準曲線。再用上述同樣的方法對10 μmol/L CueO絡合顯色，并根據(jù)標準曲線計算得到蛋白中的銅含量。

1.4 光催化還原CO2活性實驗

光催化系統(tǒng)的所有制備過程均在氬氣保護的手套箱中進行。光催化反應選用500 μL的體系，包含0.1 mol/L NaHCO3、10 μmol/L催化劑CueO、1 mmol/L光敏劑[Ru（bpy）3]2+和0.1 mol/L犧牲還原劑抗壞血酸鈉。然后密封于11 mL的玻璃容器，頂部空間用CO2吹掃。CueO在波長大于400 nm的氙燈照射下進行CO2還原的光催化實驗。反應樣品瓶距離氙燈光源15 cm并照射15 h。同時使用恒溫水浴槽中控制光照反應溫度為30 ℃。

采用氣相色譜法對光催化后的頂空氣體進行分析。根據(jù)標準氣體的量進行定量實驗得到CO的含量。光催化產(chǎn)生CO的量用TON表示，計算方法如式（1）所示。

式中：TON（turnover number）是轉(zhuǎn)化數(shù);[nCO]是CO的物質(zhì)的量，mol;[ncatalyst]是催化劑的物質(zhì)的量，mol。

2 結(jié)果與討論

2.1 CueO的組成及表達純化

CueO是有4個銅原子結(jié)合位點的金屬酶[30]，該酶的PDB號是5B7E[31]。CueO周圍的配位環(huán)境用軟件PyMol進行解析，如圖1所示。圖1a）是3個銅原子結(jié)合位點，圖1b）中含有1個單銅原子結(jié)合位點。由于CueO中的1個銅原子與2個組氨酸和1個半胱氨酸配位，因此在600 nm有特殊的紫外吸收峰。

通過SDS-PAGE檢測得到的凝膠電泳圖如圖2所示，可發(fā)現(xiàn)在20 ℃和30 ℃ CueO均可表達。根據(jù)紫外可見光譜定量，結(jié)合蛋白的摩爾吸收消光系數(shù)[ε280nm=62 730]（mol/L）?1，計算得CueO表達量大約為40 mg/L。CueO分子量約為50 kD，與計算相符，說明CueO得到很好的表達并且純度較高。

通過分子排阻層析法（Superdex 75）純化的CueO如圖3a）所示。收集單峰對應的蛋白進行SDS-PAGE鑒定。根據(jù)脫色完后得到的SDS-PAGE凝膠電泳圖如圖3b）所示，發(fā)現(xiàn)CueO純度得到提高。

2.2 紫外可見吸收光譜對CueO的表征

利用紫外可見吸收光譜對CueO進行表征，如圖4所示。實驗發(fā)現(xiàn)CueO在600 nm附近有特征吸收峰，表明CueO中含有T1型銅離子。突變體CueOC500V在600 nm附近沒有出現(xiàn)T1型銅離子特征吸收峰。通過用ICP-MS對等量的CueO和突變體CueOC500V進行Cu元素分析發(fā)現(xiàn)，CueOC500V中的銅離子嵌入率比CueO少38%。這進一步說明把結(jié)合1個銅原子的半胱氨酸殘基突變后，此處就不能結(jié)合銅原子。

本實驗中通過在培養(yǎng)體系中額外添加1 mmol/L CuSO4或CuCl2溶液提高CueO中銅的嵌入率，并通過四乙基秋蘭姆-銅絡合物顯色的方法檢測銅含量。通過標準曲線擬合得到線性相關(guān)方程y = 0.004 3x + 0.015 5（R = 0.990 2），以此計算CueO含銅量，如圖5所示。實驗發(fā)現(xiàn)，誘導過程中添加1 mmol/L CuSO4溶液最終純化得到的CueO中銅離子嵌入率為57.5% [（nCueO∶nCu2+=10∶23）]，而添加1 mmol/L CuCl2溶液最終純化得到的CueO銅離子嵌入率為67.5%[（nCueO∶nCu2+=10∶27）]。因此，發(fā)現(xiàn)額外添加含Cu2+溶液可以為CueO的4個銅結(jié)合位點提供外源銅離子，但其銅結(jié)合位點銅離子嵌入率依然不足。

2.3 光催化產(chǎn)生CO的活性檢測

在包含0.1 mol/L NaHCO3、20 μmol/L催化劑CueO、1 mmol/L光敏劑[Ru（bpy）3]2+和0.1 mol/L犧牲還原劑抗壞血酸鈉的光催化體系中，經(jīng)過15 h的光照，生成1.94 μmol的CO，同時產(chǎn)物中有少量的H2。實驗結(jié)果表明，在沒有CueO的對照組中，沒有檢測到CO，檢測到了少量的H2。其他對照組結(jié)果如表1所示，其中b～f組進一步表明在缺少[Ru（bpy）3]2+、抗壞血酸鈉、CO2氣體和光照等任何1個組分的情況下，檢測不到任何的還原產(chǎn)物，這表明光催化CO2還原系統(tǒng)中需要以上所有組分。另外給光催化的體系通入氬氣，GC沒有檢測到CO（表1中e），這表明CO的來源是CO2，而不是[Ru（bpy）3]2+或CueO的分解。

2.4 光誘導漆酶催化CO2還原反應條件的優(yōu)化

2.4.1 體系pH值對CO產(chǎn)量的影響

實驗選取pH=7、8、9的Tris-HCl緩沖液對光催化CO2還原進行反應，并用GC檢測產(chǎn)生的CO含量，如圖6所示。GC檢測到在pH=7、8、9下CO含量分別為0.059%，0.262%，0.218%，經(jīng)計算TON分別為25、115和100。根據(jù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH=8時結(jié)果比較理想。當pH小于或大于8時，該體系產(chǎn)CO的能力都會降低。這可能是由于當pH小于8時，體系中抗壞血酸鈉會質(zhì)子化，給電子能力降低，而pH大于8時，由于溶液中游離的H+減少，會降低體系活性。綜上所述，反應的pH=8用于后續(xù)光照實驗。

2.4.2 體系光敏劑[Ru（bpy）3]2+濃度對產(chǎn)CO活性的影響

光吸收效率在很大程度上取決于人工光合系統(tǒng)的光敏劑。因為光促進光敏劑的電子進入高能級的導帶，而激發(fā)空出的空穴被犧牲還原劑氧化而填充。導帶上的電子會繼續(xù)轉(zhuǎn)移到酶的活性位點，進而促進CO2催化還原。本實驗采用含金屬釕的[Ru（bpy）3]2+做為光敏劑，研究了光敏劑濃度對CueO催化活性的影響。分別測試200 μmol/L、300 μmol/L、500 μmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L濃度的[Ru（bpy）3]2+對光照活性的影響，結(jié)果如圖7所示。實驗結(jié)果表明不同濃度的光敏劑對CO2催化還原起著重要作用。隨著光敏劑濃度的增加，單位時間內(nèi)吸收的光子數(shù)增加，有利于將電荷轉(zhuǎn)移到酶的活性位點上，催化產(chǎn)生的CO增加。

2.4.3 CueO濃度對產(chǎn)CO的影響

在光催化體系下，以20 μmol/L、40 μmol/L和60 μmol/L的CueO作為催化劑，產(chǎn)生的CO活性如圖8所示。不同濃度的CueO對光催化有不同的活性。根據(jù)3次平行實驗發(fā)現(xiàn)隨催化劑CueO的濃度的增加，光驅(qū)動還原反應產(chǎn)生CO的量也隨之增加。這種現(xiàn)象是隨著CueO的濃度增加，會有更多的底物作用到酶的活性位點，催化產(chǎn)生CO的量也隨之增加。

2.4.4 不同光照時長對產(chǎn)CO活性的影響

對該體系進行3 h、6 h、12 h、15 h的光照實驗。實驗結(jié)果如圖9所示。圖中光催化產(chǎn)CO的活性隨著光照時間增加逐漸增加。當光照3 h、6 h、12 h、15 h，60 μmol/L的CueO分別產(chǎn)生0.40 μmol、0.59 μmol、0.97 μmol、1.94 μmol的CO。光照相同時間，CueO的濃度越高產(chǎn)生的CO量越多。

2.5 CueO突變對還原CO2的影響

在光催化體系下，對相同濃度的CueO和突變體CueOC500V進行光照15 h的光催化實驗。實驗結(jié)果如表2所示。CueO和突變體CueOC500V都會對光催化CO2還原產(chǎn)生活性，并且用突變體CueOC500V催化還原CO2的TON比CueO高33。因此，實驗分析CueO催化還原CO2活性位點發(fā)生在其三銅中心。

2.6 透射電鏡對CueO的表征

對于光催化反應，納米顆粒會促進體系催化反應的發(fā)生，那么起到催化作用可能就不是生物酶。為了驗證在催化過程中起催化作用的不是由于光照后形成的納米銅，對光照前后的樣品進行了透射電鏡（TEM）測試，結(jié)果如圖10所示。圖10 a）是光照前的樣品。在光照前，圖中并沒有形狀規(guī)整的顆粒存在。圖10 b）是光照后的樣品，并沒有類似顆粒物存在。由測試圖前后對照發(fā)現(xiàn)樣品在經(jīng)過光照后沒有形成納米顆粒。所以，CueO在光誘導催化CO2還原的過程中起著催化的作用。

3 結(jié)論

本文通過光合作用原理探索了可見光驅(qū)動CueO還原CO2為CO。通過比較20 ℃和30 ℃誘導表達蛋白的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白在這2個溫度下都會得到表達，溫度對其表達影響不大。進一步用分子排阻層析法純化，得到較純的CueO。通過外源加入1 mmol/L CuSO4溶液，使CueO的銅嵌入率達到57.5%以上。在可見光照射15 h后伴有192的TON值。對照實驗表明在缺少[Ru（bpy）3]2+、抗壞血酸鈉、CO2氣體和光照等任何一個條件，不會檢測到任何的還原產(chǎn)物，這表明光催化CO2還原系統(tǒng)中需要以上所有組分。隨著光敏劑濃度的增加，催化產(chǎn)生的CO增加。光催化產(chǎn)CO的活性隨著光照時間增加逐漸增加。通過對CueO進行點突變，發(fā)現(xiàn)CueO催化還原CO2活性的催化發(fā)生在其三銅中心?？梢姽怛?qū)動漆酶還原CO2為CO的機理還需進一步實驗研究。可見光驅(qū)動酶系統(tǒng)的發(fā)展對生產(chǎn)低碳燃料和緩解能源短缺具有重要意義。利用光合作用和生物酶催化相結(jié)合，太陽光為綠色化學提供了一個更環(huán)保的機會。這對酶催化CO2還原提供了新的思路。

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