趙陽 劉素芳 蘇亞雙 李俊芳 馬向波 婁重章 孫琦

摘要 目的：探究白芍總苷（TGP）對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、凋亡以及炎癥反應(yīng)的影響及其作用機(jī)制。方法：將人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（HFLS-RA）分為對照組、模型組和干預(yù)組，其中對照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng);模型組和干預(yù)組細(xì)胞使用腫瘤壞死因子（TNF）-α10 ng/mL培養(yǎng)建立RA體外細(xì)胞模型;隨后干預(yù)組細(xì)胞使用TGP 62.5 μg/mL培養(yǎng)，對照組和模型組細(xì)胞使用等量生理鹽水培養(yǎng);采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力;原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）檢測細(xì)胞的凋亡率;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）檢測白細(xì)胞介素（IL）-6和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平;Western Blotting檢測磷酸化JAK2蛋白（p-JAK2）、磷酸化STAT1蛋白（p-STAT1）以及磷酸化STAT3蛋白（p-STAT3）的表達(dá)水平。結(jié)果：CCK-8和TUNEL結(jié)果顯示TGP可抑制HFLS-RA細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;ELISA結(jié)果顯示TGP可降低細(xì)胞中IL-6和VEGF的水平;Western Blotting實(shí)驗(yàn)顯示TGP可降低p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的表達(dá)水平（P<0.05）。結(jié)論：TGP可通過調(diào)節(jié)JAK/STAT信號通路抑制HFLS-RA細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)和血管生成。

關(guān)鍵詞 白芍總苷;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;成纖維樣滑膜細(xì)胞;增殖;凋亡;白細(xì)胞介素-6;血管內(nèi)皮生長因子;JAK/STAT信號通路

Abstract Objective：To investigate the effects of total glucosides of paeony（TGP） on the proliferation，apoptosis and inflammatory response of fibroblast synovial cells in rheumatoid arthritis and its mechanism.Methods：Human fibroblast-like synoviocytes（HFLS-RA） were divided into a control group，a model group and an intervention group randomly，and the cells of the control group were cultured routinely.Cells in the model group and intervention group were cultured with tumor necrosis factor（TNF）-α 10 ng/mL to establish RA cell models in vitro.Subsequently，cells in the intervention group were cultured with TGP 62.5 μg/mL，and cells in the control group and model group were cultured with the same amount of normal saline.CCK-8 assay method was used to detect cell proliferation.Cell apoptosis rate was detected by in situ end transferase labeling（TUNEL）.The levels of interleukin（IL）-6 and vascular endothelial growth factor（VEGF） were determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expression levels of phosphorylated JAK2（p-JAK2），phosphorylated STAT1（p-STAT1） and phosphorylated STAT3（p-STAT3） were detected by Western blotting.Results：CCK-8 and TUNEL assay showed that TGP could inhibit the proliferation of HFLS-RA cells and promote cell apoptosis.ELISA assay showed that TGP can reduce the levels of IL-6 and VEGF in cells.Western blotting assay showed that TGP can reduce the expression levels of p-JAK2，p-STAT1 and p-STAT3（P<0.05）.Conclusion：TGP can inhibit HFLS-RA cell proliferation，promote cell apoptosis，inhibit synovial cell inflammation and angiogenesis by regulating JAK/STAT signaling pathway.

Keywords Total glucosides of paeony; Rheumatoid arthritis; Fibroblastoid synovial cells; Proliferation; Apoptosis; Interleukin-6; Vascular endothelial growth factor; JAK/STAT signaling pathway

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.013

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，可引起不可逆的關(guān)節(jié)損傷和嚴(yán)重殘疾，患病率約為1%[1-2]。RA發(fā)病的主要特征為滑膜組織增生和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，是由于人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（HFLS-RA）的增殖和凋亡平衡失調(diào)，導(dǎo)致HFLS-RA不斷“腫瘤樣”增生[3-4]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是眾多炎癥介質(zhì)中的關(guān)鍵因子，可產(chǎn)生有絲分裂原作用，促進(jìn)RA滑膜成纖維細(xì)胞的增殖，目前常被用來誘導(dǎo)HFLS-RA損傷構(gòu)建RA體外細(xì)胞模型[5-6]。白芍總苷（Total Glucosides of Paeony，TGP）是從中藥白芍根部提取的主要有效成分，具有益氣止痹，養(yǎng)血柔肝等功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，TGP具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗應(yīng)激等作用，并可參與某些細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，對RA等自身免疫性疾病確有療效[7-8]。然而，TGP在RA中的潛在機(jī)制尚不清楚。本研究通過構(gòu)建RA體外細(xì)胞模型，旨在探討TGP對HFLS-RA增殖、凋亡以及炎癥反應(yīng)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（HFLS-RA），購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。細(xì)胞置于添加了10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 藥物 TGP膠囊，規(guī)格：0.3 g/粒（寧波立華制藥有限公司，批號：20191203）。使用TGP膠囊時去外膠囊殼，將內(nèi)粉末溶于生理鹽水配置成TGP溶液62.5 μg/mL。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0227）;青霉素-鏈霉素溶液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0222）;化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0018FS）;DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國，貨號：A4192101）;TNF-α（Sigma公司，美國，貨號：H8916-10UG）;CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒（上海炎熙生物科技有限公司，貨號：CT-K-1）;原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海翌圣生物科技有限公司，貨號：40308ES20）;酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml057925-2）;十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳液（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：YT619）;聚氰基丙烯酰正丁酯（BCA）蛋白定量試劑盒（上海賽默飛世爾科技公司，貨號：23250）;一抗磷酸化JAK2（p-JAK2）蛋白抗體（Abcam公司，英國，貨號：ab32101）、一抗磷酸化STAT1（p-STAT1）蛋白抗體（Abcam公司，英國，貨號：ab109461）;一抗磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白抗體（Abcam公司，英國，貨號：ab267373）;GAPDH（Abcam公司，英國，貨號：ab8245）;二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（Abcam公司，英國，貨號：ab6721）;電泳儀（南京普陽科學(xué)儀器研究所，型號：DYY-6C）;快速智能蛋白濕轉(zhuǎn)儀（南京金斯瑞生物科技有限公司，型號：L00686C）;酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國，型號：synergy2）;倒置熒光顯微鏡（上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司，型號：DYF-880）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將HFLS-RA隨機(jī)分為對照組、模型組和干預(yù)組。模型組和干預(yù)組細(xì)胞使用TNF-α10 ng/mL培養(yǎng)制備RA體外細(xì)胞模型。每組3個樣本。

1.2.2 給藥方法 對照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不做任何干預(yù)處理;干預(yù)組細(xì)胞使用TGP 62.5 μg/mL培養(yǎng);模型組細(xì)胞使用等量生理鹽水培養(yǎng)。24 h后，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取HFLS-RA細(xì)胞，使用胰酶消化稀釋，以每孔1104接種于96孔板中，分別在24 h、48 h、72 h將10 μL CCK-8試劑加入每孔孵育2 h，另外在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入等量CCK-8試劑，設(shè)為空白組，而后在酶標(biāo)儀450 nm波長處測定各組細(xì)胞光密度（OD）值。

1.2.3.2 TUNEL染色細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取HFLS-RA，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，5%多聚甲醛固定5 min，PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5 min，再用3% H2O2和0.1% Triton X-100培養(yǎng)10 min，之后使用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒染色，最后用DAPI標(biāo)記1 min，37 ℃避光孵育1 h。細(xì)胞核染為綠色為凋亡細(xì)胞，熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計算每組細(xì)胞的凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3.3 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測白細(xì)胞介素（IL）-6和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平 取HFLS-RA培養(yǎng)上清液，使用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞中IL-6和VEGF水平。

1.2.3.4 Western Blotting實(shí)驗(yàn) 取HFLS-RA，使用RIPA裂解緩沖液勻漿裂解，高速離心后收集蛋白上清，用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進(jìn)行定量，再將蛋白置于水浴鍋中100 ℃下加熱10 min變性。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，隨后電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用含5%脫脂乳脂的TBST封閉2 h，加入一抗于4 ℃條件下孵育過夜。TBST溶液漂洗PVDF膜后，再加入二抗室溫孵育1 h。TBST溶液再次漂洗后使用ECL化學(xué)發(fā)光顯影，采用Image J圖像分析系統(tǒng)分析各組蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，檢測各組p-JAK2，p-STAT1，p-STAT3蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組比較用單因素方差分析，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGP對HFLS-RA細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，模型組光密度值顯著上升（P<0.05）;而與模型組比較，干預(yù)組細(xì)胞光密度值顯著降低（P<0.05）。見表1。

2.2 TGP對HFLS-RA細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組的細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;而與模型組比較，干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2，圖1。

2.3 TGP對HFLS-RA細(xì)胞中IL-6和VEGF水平的影響 與對照組比較，模型組中IL-6和VEGF水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;而與模型組比較，干預(yù)組中IL-6、VEGF的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.4 TGP抑制HFLS-RA細(xì)胞中p-JAK2，p-STAT1，p-STAT3蛋白的表達(dá) 與對照組比較，模型組中p-JAK2，p-STAT1，p-STAT3的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;而與模型組比較，干預(yù)組中p-JAK2，p-STAT1，p-STAT3的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4，圖2。

3 討論

HFLS-RA在RA病理過程中發(fā)揮重要作用，具有增殖和凋亡異常的特點(diǎn)[9]，因此抑制HFLS-RA的異常增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡成為治療RA的主要策略之一[10-11]。另外，HFLS-RA是滑膜炎癥增生的主要效應(yīng)細(xì)胞，在炎癥刺激下可分泌大量炎癥介質(zhì)，如IL-6等。VEGF是促進(jìn)血管形成的重要細(xì)胞因子，同時參與RA發(fā)病過程[12-13]。TGP主要含有芍藥苷，羥基芍藥苷、芍藥花苷以及芍藥內(nèi)酯苷等成分，研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制自身免疫反應(yīng)的作用，可在RA的治療過程中發(fā)揮療效[14-15]。如賈敏等[16]發(fā)現(xiàn)，TGP可減輕關(guān)節(jié)炎大鼠足趾腫脹度以及炎關(guān)節(jié)部位的骨質(zhì)破壞情況;戴杏等[17]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷可降低TNF-α刺激下成纖維滑膜細(xì)胞中IL-1β和前列腺素E2的水平，并提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷腺苷水平。本研究通過使用TNF-α刺激細(xì)胞構(gòu)建RA體外細(xì)胞模型，而后給予TGP聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TGP可顯著抑制HFLS-RA增殖以及炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這提示TGP對HFLS-RA具有保護(hù)作用。

Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT）信號通路是一種可介導(dǎo)生長因子和炎癥介質(zhì)的信號途徑，包括JAK2，STAT1，STAT3等蛋白[18-20]。研究表明，JAK/STAT信號通路與RA等自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，涉及自身免疫的許多細(xì)胞因子都使用JAK和STAT來轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號，且在RA滑膜關(guān)節(jié)組織中持續(xù)激活，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的大量分泌[21]。本研究證實(shí)，使用TNF-α刺激HFLS-RA可激活JAK/STAT信號通路，增加JAK2，STAT1，STAT3等蛋白的磷酸化水平[22]。TGP處理HFLS-RA后，p-JAK2，p-STAT1，p-STAT3的表達(dá)均得到顯著抑制。

綜上所述，TGP可顯著抑制HFLS-RA的過度增殖和炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)JAK/STAT信號通路而實(shí)現(xiàn)。

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（2021-07-06收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）