潘晶晶 鄒蕾 黃志遠(yuǎn) 孫香蕾

摘要 目的：探討大麻素1型受體（CB1R）過(guò)表達(dá)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的影響。方法：建立EAE小鼠模型（n=50）并設(shè)置佐劑組（n=10）和對(duì)照組（n=10），建模成功的EAE小鼠注射CB1R過(guò)表達(dá)慢病毒液并記為CBlR過(guò)表達(dá)組（n=20），設(shè)置空載體組（n=10）和EAE模型組（n=20）。評(píng)價(jià)各組小鼠神經(jīng)功能，觀察對(duì)照組、EAE模型組和CBlR過(guò)表達(dá)組小鼠的腦組織病理學(xué)變化，檢測(cè)腦組織CB1R、室管膜下區(qū)Brdu和Brdu+/Nestin+以及Sox-2 mRNA水平。結(jié)果：EAE模型組神經(jīng)功能評(píng)分升高、CBlR蛋白降低（P<0.05），CBlR過(guò)表達(dá)組神經(jīng)功能評(píng)分下降、CBlR蛋白升高（P<0.05）。EAE模型組腦組織出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及髓鞘缺失等典型病理變化，CBlR過(guò)表達(dá)組的病理?yè)p傷顯著改善。EAE模型組Brdu、Brdu+/Nestin+陽(yáng)性細(xì)胞以及Sox-2mRNA水平均顯著增加（均P<0.05），CBlR過(guò)表達(dá)組比較EAE模型組亦顯著增加（P<0.05）。結(jié)論：過(guò)表達(dá)CBlR可能是通過(guò)加速小鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的增殖從而促進(jìn)腦組織損傷的修復(fù)，最終有效減輕了自身免疫性腦脊髓炎小鼠的癥狀。

關(guān)鍵詞 大麻素1型受體;過(guò)表達(dá);實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎;小鼠;腦組織室管膜下區(qū);神經(jīng)干細(xì)胞;5-溴-2′-脫氧尿苷;巢蛋白

Abstract Objective：To investigate the effect of cannabinoid 1 receptor（CB1R） overexpression on cerebral nerve stem cells in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.Methods：EAE models（50 mice） were established，as well as an adjuvant group of 10 and a control group of 10 mice.In the models built successfully，EAE mice were injected with CB1R overexpression lentivirus and recorded as CBlR overexpression group（20 mice）.Null vector group（10 mice） and the EAE model group（20 mice） were also set.Neurological functions of mice in each group were evaluated，pathological changes of brain tissue were observed，and levels of CB1R，Brdu and Brdu+/Nestin+ in subependymal area and SOX-2 mRNA of brain tissue were detected.Results：In the EAE model group，neurological function score increased and CBlR protein decreased（P<0.05），while neurological function score decreased and CBlR protein increased in the CBlR overexpression group（P<0.05）.Typical pathological changes，such as inflammatory infiltration and myelin loss，occurred in the EAE model group.Pathological damage was significantly improved in the CBlR overexpression group.The levels of Brdu，Brdu+/Nestin+ positive cells and SOX-2 mRNA in the EAE model group were significantly increased（P<0.05），and so were the other two groups（P<0.05）.Conclusion：Overexpression of CBlR may promote the repair of brain tissue damage by accelerating the proliferation of brain neural stem cells in mice，and effectively alleviate the symptoms of autoimmune encephalomyelitis in the end.

Keywords Cannabinoid 1 receptor; Overexpression; Experimental autoimmune encephalomyelitis; Mice; Subependymal area of brain tissue; Neural stem cells;5-bromo-2′-deoxyuridine; Nestin

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.016

作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）疾病，多發(fā)性硬化（Multiple Sclerosis，MS）的主要病理特點(diǎn)為髓鞘脫失、炎癥損傷且伴發(fā)軸索的丟失。其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確，但免疫調(diào)節(jié)功能異常被認(rèn)為與該病密切相關(guān)[1-3]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE）的病理及免疫特征與多發(fā)性硬化相似，因而常被作為最經(jīng)典的動(dòng)物模型廣泛用于多發(fā)性硬化的基礎(chǔ)研究[4-5]。具有自我更新并長(zhǎng)期保持多項(xiàng)分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞（Neural Stem Cells，NSCs）經(jīng)過(guò)一定條件的誘導(dǎo)可增殖分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞[6]。內(nèi)源性大麻素、大麻素受體（Cannabinoid Receptor，CBR）、調(diào)節(jié)大麻素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及失活的相關(guān)蛋白、酶類均為內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（Endocannabinoid System，ECS）的主要組成部分。ECS被認(rèn)為可抑制神經(jīng)興奮性毒性，參與免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的穩(wěn)定，最終起到保護(hù)神經(jīng)的作用[7]。大麻素1型受體（CB1R）和大麻素2型受體（CB2R）是大麻素受體的2種類型，均為G蛋白偶聯(lián)受體[8]。以往研究證實(shí)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)功能失調(diào)發(fā)生于多發(fā)性硬化中，而CB1R是目前被公認(rèn)且研究較多的大麻素受體類型。本研究通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)CB1R的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型，觀察小鼠腦組織神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物5-溴-2′-脫氧尿苷（5-bromo-2′-deoxyuridine，Brdu）、神經(jīng)上皮前體細(xì)胞中的一種中間絲蛋白巢蛋白（Nestin）以及轉(zhuǎn)錄因子Sox-2的變化，探討CB1R對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的影響及對(duì)該病的可能保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取70只6～8周齡健康雌性C57B/L6小鼠，22～25 g/只，采購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）-2019-0010]，實(shí)驗(yàn)前于20～24 ℃室溫下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，其間讓小鼠自由飲水進(jìn)食。

1.1.2 試劑與儀器 MOG35-55肽段（北京聯(lián)科生物公司，貨號(hào)：FS1061）;完全弗氏佐劑（CFA）（Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：F5881）;百日咳毒素（PTX）（Enzo Life Sciences公司，美國(guó)，貨號(hào)：BML-G100-0050）;過(guò)表達(dá)CB1R慢病毒及空載體對(duì)照由上海吉?jiǎng)P設(shè)計(jì)并構(gòu)建;Anti-Cannabinoid Receptor I抗體（兔多克隆抗體to Cannabinoid Receptor I，Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab23703）;Anti-BrdU抗體[BU1/75（ICR1）]（HRP，Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab220507）;Anti-Nestin抗體（EPR22023，Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab221660）;驢抗大鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）預(yù)吸附二抗（Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab150153）;山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 647）預(yù)吸附二抗（Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab150083）;垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（BioRad公司，美國(guó)，型號(hào)：1658003）;酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國(guó)，型號(hào)：synergy2）;光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本，型號(hào)：BX51F32H01）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司，美國(guó)，型號(hào)：7500Fast）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 所有小鼠分為5組，分別是EAE模型組、佐劑組、對(duì)照組、CBlR過(guò)表達(dá)組和空載體組。取3 mg MOG35-55肽段溶于1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，另取3 mg結(jié)核菌素溶于1 mL完全弗氏佐劑中，各取相同體積的2種溶液置于針管中，充分混合使其成油包水乳白色混懸液，靜置無(wú)分層即為合格的MOG35-55抗原混懸液。

建模方法：1）EAE模型組（20只）：以每只C57B/L6小鼠200 μL的劑量于其背部脊柱兩側(cè)分4點(diǎn)注射，同時(shí)以200 ng/只的劑量尾靜脈注射百日咳毒素（PTX），為加強(qiáng)免疫，48 h后腹腔注射相同劑量的百日咳毒素（PTX）。2）佐劑組（10只）：混懸液中用1 mL PBS取代MOG35-55，免疫方法與EAE模型組相同。3）對(duì)照組（10只）：僅注射相同體積的生理鹽水。4）CBlR過(guò)表達(dá)組（20只）：建模成功的EAE小鼠注射CB1R過(guò)表達(dá)慢病毒液。5）空載體組（10只）：注射相同體積的攜帶空載體的慢病毒液。

1.2.2 干預(yù)方法 取建模成功的EAE小鼠30只隨機(jī)分為2組，CBlR過(guò)表達(dá)組（n=20）：發(fā)病當(dāng)天于EAE小鼠L4/5間隙注射過(guò)表達(dá)CB1R慢病毒液;空載體組（n=10）：發(fā)病當(dāng)天于EAE小鼠L4/5之間注射相同體積的攜帶空載體的慢病毒液。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 從免疫當(dāng)天開始至免疫后第28天對(duì)空載體組、佐劑組、對(duì)照組、EAE模型組及CBlR過(guò)表達(dá)組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：無(wú)癥狀記0分;垂尾記1分;輕微后肢無(wú)力、行路不穩(wěn)及翻正反射遲鈍記2分;后肢麻痹和（或）前肢力弱記3分;前肢麻痹記4分;四肢癱記5分;瀕臨死亡或死亡記6分。

1.2.3.2 Western Blotting檢測(cè)CB1R蛋白表達(dá) 免疫后第28天將對(duì)照組、EAE模型組及CBlR過(guò)表達(dá)組小鼠處死并取其大腦組織，用動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量。將制備的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，之后轉(zhuǎn)模至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫下加含5%BSA的封閉液作用2 h，加入用封閉液稀釋的兔抗小鼠CB1R一抗，置于4 ℃冰箱過(guò)夜。次日取出復(fù)溫，加適量PBST洗膜3次，10 min/次，再加稀釋好的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫震蕩孵育1 h，PBST洗膜，干凈后加ECL顯色，暗室曝光拍照，同時(shí)以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.2.3.3 HE染色和WEIL染色觀察組織病理學(xué)變化 將對(duì)照組、EAE模型組及CBlR過(guò)表達(dá)組小鼠處死后取其脊髓腰膨大處組織，4%甲醛溶液固定后，依次經(jīng)石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水等步驟，分別經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色和WEIL染色，二甲苯透明后用中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化以及髓鞘脫失情況。

1.2.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦組織室管膜下區(qū)Brdu的表達(dá) 處死對(duì)照組、EAE模型組及CBlR過(guò)表達(dá)組小鼠。用生理鹽水將Brdu稀釋成20 mg/mL的溶液，于小鼠被處死前2 d以100 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射，1次/d，連續(xù)2 d。第3天腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，沿肋骨內(nèi)緣切開橫膈以使心臟暴露，經(jīng)左心室將注射器刺入主動(dòng)脈，剪開右心耳，灌注生理鹽水至流出液清亮后，再先快后慢灌注4%多聚甲醛至小鼠尾巴、四肢僵直，1 h后將腦組織取出后置于4%的多聚甲醛溶液4 ℃固定48 h，然后用30%蔗糖進(jìn)行脫水處理48 h，于冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，防凍液中-20 ℃保存?zhèn)溆?。?jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）靜置水化及沖洗，加封閉液室溫作用1 h，加稀釋好的大鼠抗Brdu單克隆抗體4 ℃過(guò)夜，次日，PBST洗滌，再加稀釋好的驢抗大鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）預(yù)吸附二抗孵育，PBST洗滌，加防熒光衰減劑并封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3.5 免疫熒光檢測(cè)腦組織室管膜下區(qū)Brdu+/Nestin+的表達(dá) 取對(duì)照組、EAE模型組及CBlR過(guò)表達(dá)組小鼠腦組織切片，用PBS靜置水化及沖洗，加封閉液室溫作用1 h，加稀釋好的大鼠抗Brdu單克隆抗體4 ℃過(guò)夜，次日，PBST洗滌，再加稀釋好的驢抗大鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）預(yù)吸附二抗孵育，PBST洗滌，依次加4%多聚甲醛常溫避光15 min，2N HCl于37 ℃避光30 min，0.1 mol/L硼酸常溫避光震蕩孵育10 min，PBST洗滌，加稀釋好的Anti-Nestin單克隆抗體4 ℃避光過(guò)夜，次日，復(fù)溫后PBST洗滌，加山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 647）預(yù)吸附二抗37 ℃孵育2 h，PBST沖洗干凈，滴加防熒光衰減劑并封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3.6 RT-qPCR檢測(cè)腦組織Sox-2mRNA的水平 將對(duì)照組、EAE模型組及CBlR過(guò)表達(dá)組小鼠脊髓組織投入液氮罐中反復(fù)凍存使其破碎，用Trizol提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)組織中Sox-2的表達(dá)水平。同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參基因。每個(gè)樣本均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 GraphPad Prism 5.0軟件用于作圖，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，2組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 EAE模型組小鼠在免疫后食欲有所減退，體質(zhì)量逐漸下降，免疫后10 d開始陸續(xù)發(fā)病，初期尾部張力減弱或消失，之后步態(tài)笨拙，行動(dòng)不便，隨著癥狀加重最終發(fā)生雙后肢癱瘓。佐劑組和對(duì)照組均未出現(xiàn)任何腦脊髓炎癥狀，各時(shí)間點(diǎn)的平均神經(jīng)功能評(píng)分都是0分，且體質(zhì)量隨著生長(zhǎng)不斷增加。空載體組小鼠與EAE模型組小鼠在免疫后10 d、14 d、21 d和28 d的平均神經(jīng)功能評(píng)分分別是0.9、1.4、2.3和2.8分，表現(xiàn)相似，神經(jīng)功能評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。CBlR過(guò)表達(dá)組不同時(shí)間點(diǎn)的平均神經(jīng)功能評(píng)分分別是0.9、1.3、1.4和1.6分，與EAE模型組比較，CBlR過(guò)表達(dá)組隨著CBlR表達(dá)量的增加，腦脊髓炎癥狀逐漸減輕，神經(jīng)功能評(píng)分顯著下降（P<0.05）。見圖1。

2.2 小鼠腦組織中CB1R蛋白表達(dá) Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、EAE模型組和CBlR過(guò)表達(dá)組小鼠腦組織中CBlR/GAPDH分別是0.45、0.18和0.39。EAE模型組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CBlR過(guò)表達(dá)組相較于EAE模型組顯著回升，趨近于對(duì)照組（P<0.05）。見圖2。

2.3 各組小鼠組織病理學(xué)變化 HE染色發(fā)現(xiàn)，EAE模型組小鼠脊髓腰膨大處組織中出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞為主的大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且呈典型的“袖套”狀聚集在血管周圍;對(duì)照組極少見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)病灶，CBlR過(guò)表達(dá)組病理變化顯著改善，趨向于正常。見圖3。

WEIL染色結(jié)果顯示，EAE模型組小鼠組織中有大小及形狀不一的點(diǎn)狀或成片的白色空泡，即為髓鞘缺失區(qū)域，高倍鏡下觀察該區(qū)域可見存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);對(duì)照組小鼠髓鞘整齊而完好，CBlR過(guò)表達(dá)組亦極少出現(xiàn)髓鞘缺失區(qū)域。見圖4。

2.4 各組小鼠腦組織室管膜下區(qū)Brdu的表達(dá) 小鼠腦組織室管膜下區(qū)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞核呈不規(guī)則形、橢圓形或圓形，成簇或散在分布。對(duì)照組、EAE模型組和CBlR過(guò)表達(dá)組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率分別是14%、18%和27%。EAE模型組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加比對(duì)照組顯著（P<0.05），CBlR過(guò)表達(dá)組增加比EAE模型組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖5。

2.5 各組小鼠腦組織室管膜下區(qū)Brdu+/Nestin+的表達(dá) 對(duì)照組、EAE模型組和CBlR過(guò)表達(dá)組小鼠腦組織室管膜下區(qū)Brdu+/Nestin+陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率分別是2.3%、9.9%和18.2%。EAE模型組小鼠腦組織室管膜下區(qū)Brdu+/Nestin+的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與EAE模型組比較，CBlR過(guò)表達(dá)組顯著升高（P<0.05）。見圖6。

2.6 各組小鼠腦組織Sox-2mRNA的水平 對(duì)照組、EAE模型組和CBlR過(guò)表達(dá)組小鼠腦組織中Sox-2/β-actin分別是0.14、0.38和0.61。與對(duì)照組比較，EAE模型組小鼠腦組織中Sox-2mRNA水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與EAE模型組比較，CBlR過(guò)表達(dá)組亦顯著增加（P<0.05）。見圖7。

3 討論

大麻素1型受體（CB1R）主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，腦內(nèi)的CB1R主要存在于大腦皮質(zhì)、小腦、海馬CA錐體細(xì)胞層以及基底神經(jīng)節(jié)的蒼白球、黑質(zhì)和外側(cè)紋狀體。其功能為參與運(yùn)動(dòng)與體位控制、認(rèn)知、情感、記憶、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等[9-10]。大麻素受體（CBR）被證實(shí)在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)保護(hù)的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，CBlR在正常小鼠腦內(nèi)的神經(jīng)元中表達(dá)較多，少量表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞中，星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)。此外，在MS患者的皮質(zhì)神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞均有CB1R的表達(dá)[11-13]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和佐劑組均未發(fā)病，EAE模型小鼠出現(xiàn)腦脊髓炎癥狀，神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高，空載體組與EAE模型組癥狀相似，CBlR過(guò)表達(dá)組小鼠腦脊髓炎癥狀逐漸減輕，神經(jīng)功能評(píng)分顯著下降。該結(jié)果表明EAE模型小鼠成功建立，CBlR可減輕EAE的臨床癥狀。EAE模型組小鼠腦組織中CBlR蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，CBlR過(guò)表達(dá)組顯著升高，提示EAE能降低CBlR蛋白水平，EAE模型小鼠成功實(shí)現(xiàn)CBlR過(guò)表達(dá)。目前已發(fā)現(xiàn)多發(fā)性硬化（MS）的主要病理變化為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘脫失以及軸索損傷等。本研究經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)EAE模型小鼠脊髓腰膨大處組織中大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)且呈典型的“袖套”狀聚集在血管周圍，CBlR過(guò)表達(dá)組病理變化改善顯著，趨向于對(duì)照組。WEIL染色發(fā)現(xiàn)EAE模型小鼠髓鞘缺失且高倍鏡下可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，CBlR過(guò)表達(dá)組極少出現(xiàn)髓鞘缺失區(qū)域，大多髓鞘完好而整齊。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)構(gòu)建的EAE模型小鼠出現(xiàn)典型的病理改變，CBlR則可逆轉(zhuǎn)EAE對(duì)小鼠組織的病理?yè)p傷。

作為一種胸腺嘧啶脫核尿苷類似物，Brdu在細(xì)胞周期的S期可嵌入到細(xì)胞核DNA，常被用作具有增殖活性細(xì)胞的標(biāo)志物，因此新生成的神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）可采用其陽(yáng)性細(xì)胞來(lái)表示[14]。DNA進(jìn)行半保留復(fù)制且在S期合成，此時(shí)將DNA合成所需要的原料進(jìn)行標(biāo)記或者加入原料的類似物，均可進(jìn)入DNA雙鏈進(jìn)而標(biāo)記出新增殖的細(xì)胞[15]。以往觀點(diǎn)認(rèn)為人和其他哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)被損傷后很難恢復(fù)，而近年來(lái)隨著干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，NSCs已相繼從嚙齒類動(dòng)物、人的胎盤及成年腦組織中被分離純化出來(lái)[16]。此外，成體哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)側(cè)腦室壁的室管膜下區(qū)（SVZ）及海馬齒狀回的顆粒下層（SGZ）被證實(shí)為NSCs的2個(gè)聚集區(qū)[17]。神經(jīng)上皮前體細(xì)胞中的一種中間絲蛋白巢蛋白（Nestin），在整個(gè)成年期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域均表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Sox-2均常被用做NSCs的標(biāo)志物[18-19]。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠腦組織室管膜下區(qū)Brdu及Brdu+/Nestin+陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，EAE模型組比對(duì)照組顯著增加，CBlR過(guò)表達(dá)組比較EAE模型組亦顯著增加。RT-qPCR檢測(cè)小鼠腦組織Sox-2mRNA表達(dá)水平與Brdu一致。分析原因可能跟其作用機(jī)制有關(guān)，正常生理?xiàng)l件下，NSCs不發(fā)生增殖分化而是處于相對(duì)靜息狀態(tài)，腦組織發(fā)生病理?yè)p傷可導(dǎo)致微環(huán)境的變化，若該刺激達(dá)到NSCs分裂增殖的閾值時(shí)，NSCs則自我復(fù)制產(chǎn)生新細(xì)胞，并進(jìn)行規(guī)律性遷移到達(dá)特定部位，根據(jù)需要分化為相應(yīng)區(qū)域的細(xì)胞，進(jìn)而替代損傷細(xì)胞并重建神經(jīng)功能發(fā)揮作用[20]。炎癥介質(zhì)透過(guò)血腦屏障進(jìn)入EAE小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，微環(huán)境的變化使NSCs被激活，因而EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)NSCs開始增殖;CBlR過(guò)表達(dá)組NSCs增殖水平顯著高于EAE模型組，提示CBlR可能是通過(guò)加速小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NSCs的增殖進(jìn)而促進(jìn)腦組織損傷的修復(fù)。

綜上所述，過(guò)表達(dá)CBlR可加速小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)腦組織損傷的修復(fù)，最終實(shí)現(xiàn)有效減輕自身免疫性腦脊髓炎小鼠的癥狀。

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（2020-04-25收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）