潘紅梅，臧勝芹，張 亮，張鳳鳴，李興桂，周光斌*

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川成都 611130；3.綏江縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南綏江 657700）

在卵母細(xì)胞體內(nèi)外發(fā)育過程中，母體老化、飼料中某些毒副因素、培養(yǎng)條件及玻璃化冷凍等均會引起活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）過量累積，造成氧化應(yīng)激，導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂異常、基因表達(dá)紊亂以及凋亡等現(xiàn)象[1-2]，從而降低卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力。因此，減少氧化應(yīng)激損傷是促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的關(guān)鍵。褪黑素（Melatonin，MT）又名N-乙?；?5-甲氧基色氨，是由哺乳動物松果體中合成分泌的一種吲哚類激素，屬于色氨酸的衍生物，能夠降低卵母細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平[3]，緩解上述情況發(fā)生，促進(jìn)綿羊、豬、牛、水牛、小鼠和人類卵母細(xì)胞和胚胎的發(fā)育[4-9]。本文從褪黑素對卵母細(xì)胞成熟的影響及其機(jī)制等方面加以綜述，以期為褪黑素在家畜生殖調(diào)控中的應(yīng)用提供參考。

1 褪黑素概述

褪黑素最早是由Lerner 等[10]在牛的松果體中分離得到的一類吲哚胺物質(zhì)，其合成和分泌受光周期調(diào)節(jié)。光周期信息經(jīng)哺乳動物視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞接收，通過多突觸神經(jīng)通路傳遞至松果體，調(diào)節(jié)褪黑素分泌，影響晝夜節(jié)律和睡眠，甚至調(diào)控哺乳動物的季節(jié)性繁殖[11]。褪黑素也是一種強(qiáng)大的抗氧化劑和抗凋亡劑，具有直接清除自由基、調(diào)節(jié)抗氧化酶（如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶）的基因表達(dá)、減少活性氧和活性氮產(chǎn)生，防止細(xì)胞氧化損傷，保護(hù)細(xì)胞中的大分子物質(zhì)等能力[12]。

褪黑素膜受體MTI 和MT2 均屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族，兩者具有不同的分子結(jié)構(gòu)、分子生物學(xué)特性和染色體位置[13]。褪黑素可通過膜受體、核受體視黃酸相關(guān)孤兒核受體（RORs）以及與細(xì)胞質(zhì)分子的相互作用影響細(xì)胞生理[14]，影響p21和5-LOX等在細(xì)胞增殖中具有重要功能基因的轉(zhuǎn)錄[15]。

2 外源性褪黑素對哺乳動物卵母細(xì)胞的影響

2.1 外源性褪黑素有利于體內(nèi)卵母細(xì)胞發(fā)育 體內(nèi)正常發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞處于低氧環(huán)境，卵泡液中含有的自由基清除劑和抗氧化酶可保護(hù)卵母細(xì)胞免受氧化損傷[16]。褪黑素作為抗氧化物質(zhì)之一，能直接清除ROS 與自由基[17]；也可通過增加抗氧化酶和谷胱甘肽（GSH）的表達(dá)水平與活性來抑制促氧化酶從而減少細(xì)胞氧化損傷[18]?；诖耍庠葱蕴砑油屎谒啬芨纳品钦顟B(tài)下母體（疾病、老齡）的繁殖力。其中，口服褪黑素可抑制過量ROS 產(chǎn)生，保護(hù)正常卵泡發(fā)育，治療人卵巢早衰[19]。而在不同孕期小鼠飲水中添加褪黑素，早孕小鼠的胚胎著床、孕前黃體發(fā)育和子宮容受性都有所提高，這可能與褪黑素上調(diào)了參與卵巢孕烯醇酮合成和子宮內(nèi)膜表達(dá)的基因有關(guān)[20]。外源性褪黑素對不同動物體內(nèi)卵母細(xì)胞發(fā)育的影響見表1。

表1 外源性褪黑素對不同動物體內(nèi)卵母細(xì)胞發(fā)育的影響

隨著年齡增長，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，高度老年化母體的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中非整倍體增多與卵泡液中褪黑素豐度的降低高度相關(guān)[21]。老齡小鼠卵母細(xì)胞暴露于外源性褪黑素不僅可以減少ROS 誘導(dǎo)的DNA 損傷和凋亡，還可以抑制由紡錘體/染色體缺陷引起的非整倍體的發(fā)生[22]。卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量逐漸降低的過程被認(rèn)為是哺乳動物生殖衰老的過程。有研究采用自然衰老小鼠模型，探討褪黑素對卵母細(xì)胞質(zhì)量影響的可能機(jī)制，數(shù)據(jù)表明，外源補(bǔ)充褪黑素能夠顯著降低老年小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂缺陷的發(fā)生率[23]。

2.2 外源性褪黑素可促進(jìn)卵母細(xì)胞的體外成熟 體外培養(yǎng)過程中，卵母細(xì)胞對溫度、滲透壓、氧氣、營養(yǎng)限制、pH 和毒素等[26]外源因素的變化高度敏感，易產(chǎn)生大量ROS，引起細(xì)胞DNA 損傷、線粒體功能紊亂、早期凋亡等，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的成熟。褪黑素作為一種強(qiáng)有力的抗氧化劑和自由基清除劑，能顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，清除自由基，促進(jìn)卵母細(xì)胞的體外成熟。

2.2.1 褪黑素可降低卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平 體外成熟（IVM）卵母細(xì)胞處于一個(gè)相對高氧的環(huán)境，缺乏自由基清除劑和抗氧化酶保護(hù)，容易產(chǎn)生過量ROS，從而表現(xiàn)出較低的質(zhì)量和發(fā)育潛力。褪黑素能夠有效緩解氧化應(yīng)激，顯著降低早期凋亡水平，提高卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物（COCs）的發(fā)育，提高卵母細(xì)胞核成熟，顆粒細(xì)胞擴(kuò)張、有助于受精、卵裂及囊胚的形成和發(fā)育。研究表明，體外成熟培養(yǎng)液中添加 10-9mol/L 褪黑素可有效緩解牛卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激，提高卵母細(xì)胞成熟率，保護(hù)其紡錘體與線粒體完整性，改善其表觀修飾，從而提高卵母細(xì)胞質(zhì)量和發(fā)育潛力，并顯著促進(jìn)后續(xù)克隆胚胎和體外受精胚胎的發(fā)育[16]。褪黑素可提高豬腔前卵泡卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合體的發(fā)育能力[6]。添加10-7mol/L褪黑素可通過促進(jìn)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，促進(jìn)人卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育[27]。在山羊幼年卵母細(xì)胞體外成熟過程中，添加褪黑素可降低ROS 水平和提高線粒體活性，提高幼年山羊卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[28]。

2.2.2 褪黑素能夠改善卵母細(xì)胞線粒體功能 線粒體合成的ATP 是卵母細(xì)胞發(fā)育所需能量的重要來源[29]。高氧環(huán)境下，線粒體基因組 (mtDNA) 由于無核膜包被、無組蛋白保護(hù)等極易受到自由基攻擊而損傷[30]。當(dāng)線粒體功能受損時(shí)，除通過線粒體自身的堿基切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)等機(jī)制減少損傷外，外源補(bǔ)充褪黑素可改善卵母細(xì)胞質(zhì)量，提升卵母細(xì)胞發(fā)育潛力。褪黑素可通過有效抑制IVM 培養(yǎng)過程中的環(huán)境應(yīng)激，降低細(xì)胞內(nèi)過量的Ca2+水平[31]，維持卵母細(xì)胞線粒體氧化磷酸化功能，為后續(xù)胚胎發(fā)育提供充足ATP[32]。GV 期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍會使線粒體膜電位和ATP 含量下降，異常紡錘體增加，而添加褪黑素可顯著緩解上述現(xiàn)象[33]。類似地，褪黑素也可改善綿羊卵母細(xì)胞線粒體功能，促進(jìn)其恢復(fù)減數(shù)分裂[34]。綜上，褪黑素可優(yōu)化線粒體功能，在IVM 期間保持卵母細(xì)胞線粒體膜電位，增加ATP 含量，促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育。

2.2.3 褪黑素能夠保護(hù)卵母細(xì)胞免受某些環(huán)境毒素的損害 隨著污染越來越嚴(yán)重，環(huán)境中某些有毒物質(zhì)對卵母細(xì)胞會產(chǎn)生毒副作用。研究發(fā)現(xiàn)，減數(shù)分裂成熟過程中，小鼠卵母細(xì)胞暴露在苯并芘（B[ghi]P）中會引起卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，加入褪黑素后能緩解該現(xiàn)象[35]。褪黑素對雙酚A（BPA）誘導(dǎo)的小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量惡化有挽救作用[36]。此外，動物采食的飼料中也可能會含有一些毒副物質(zhì)。如滅草凈（Fenoxaprop-ethyl，F(xiàn)E）可破壞卵母細(xì)胞骨架的完整性和誘導(dǎo)過量ROS 積累而導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂異常，而褪黑素可緩解滅草凈導(dǎo)致的缺陷[37]。褪黑素還可以抑制卵丘細(xì)胞中黃曲霉毒素B1（AFB1）的代謝[38]。有研究報(bào)道了赭曲霉素（OTA）對豬卵母細(xì)胞質(zhì)量的毒性以及褪黑素對OTA 暴露的卵母細(xì)胞具有保護(hù)作用[39]。MEHP 是增塑劑（DHEP）在體內(nèi)的活性代謝物，研究發(fā)現(xiàn)褪黑素對MEHP 誘導(dǎo)的豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂缺陷有明顯的改善作用[40]。

3 褪黑素對卵母細(xì)胞體外成熟后繼續(xù)發(fā)育的影響

目前，豬、牛、羊等家畜的體外胚胎囊胚發(fā)育率分別 為17.9%[41]、37.1%～52.8%[42]、34%～43.4%[43]，很 大程度上限制了體外胚胎的生產(chǎn)效率，因此改善體外成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育效率至關(guān)重要。哺乳動物卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)基中添加一定濃度的褪黑素有利于調(diào)節(jié)細(xì)胞器正常分布，增加GSH 和 ATP 含量，提高抗氧化基因表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞受精和發(fā)育能力[44]。褪黑素處理山羊幼年卵母細(xì)胞，受精后第8 天檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著低于對照組，線粒體活性和ATP 含量均有所提高，囊胚質(zhì)量得到改善[28]。生理濃度（10-9mol/L）的褪黑素不僅能促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的成熟率，也會增加孤雌胚泡的囊胚率和細(xì)胞數(shù)量[45]。當(dāng)培養(yǎng)液中褪黑素的添加濃度過高（如10-3mol/L）時(shí)，可能對著床前胚胎有一定的毒性作用，胚胎體外孵化率僅為15%，顯著低于10-9mol/L 添加組[9]。不同物種卵母細(xì)胞或胚胎體外發(fā)育過程中添加適宜褪黑素濃度詳見表2。

表2 不同物種卵母細(xì)胞體外發(fā)育過程中添加適宜外源性褪黑素濃度范圍

4 褪黑素促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟的潛在機(jī)制

褪黑素以膜受體依賴或非依賴方式保護(hù)卵母細(xì)胞，降低氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟。

4.1 膜受體依賴方式 研究表明，牛卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞細(xì)胞膜上均檢測到褪黑素受體（MTl 和MT2）的表達(dá)[46]，而有研究顯示，牛卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜上兩類受體均表達(dá)，但卵丘細(xì)胞的細(xì)胞膜上只有MT2 受體[47]。盡管如此，當(dāng)卵母細(xì)胞成熟液中添加褪黑素受體激動劑或拮抗劑時(shí)，受體激動劑改善牛卵母細(xì)胞體外成熟，拮抗劑抑制牛卵母細(xì)胞成熟，表明褪黑素的確可通過其受體信號通路作用促進(jìn)牛卵母細(xì)胞體外成熟[46]。類似的研究也顯示，豬的卵丘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中有褪黑素受體mRNA 表達(dá)，褪黑素可能通過受體介導(dǎo)直接對卵母細(xì)胞成熟起作用[48]。

褪黑素受體可通過G 蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號抑制cAMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞活動。MT1 激活可下調(diào)細(xì)胞內(nèi)激活蛋白激酶A（PKA）活性，抑制AC/ cAMP/PKA/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）通路，進(jìn)而降低cAMP 的生成，刺激鉀離子通道和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)；活化的MT1 還可誘導(dǎo)一過性的胞質(zhì)鈣離子與磷酸肌醇濃度升高[49]。而MT2 受體激活蛋白激酶C（PKC），誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放。褪黑素通過膜受體介導(dǎo)機(jī)制上調(diào)卵母細(xì)胞成熟相關(guān)基因GDF9和MARF1、表觀遺傳修飾基因DNMT1a、卵丘擴(kuò)張基因PTX3和HAS1/2的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟[46]。此外，褪黑素也能與核受體RZR/RORa結(jié)合，進(jìn)而引起 RZR 調(diào)控元件結(jié)合p21和5-脂氧合酶等基因的啟動子，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄[50]。

4.2 非受體依賴方式 單細(xì)胞RNA 測序發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素可通過上調(diào)線粒體氧化磷酸化通路中與ATP 生成相關(guān)COX17、ATP6V1G2等6 個(gè)基因，有效抑制人卵母細(xì)胞IVM 培養(yǎng)期間的環(huán)境應(yīng)激，較好地維持線粒體氧化磷酸化功能和ROS 生成與抗氧化能力之間的平衡，為后續(xù)胚胎發(fā)育提供足夠ATP[32]。Bcl-2（抗凋亡基因）或Bax（促凋亡基因）表達(dá)量的高低對細(xì)胞是生存或死亡起決定作用。在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)基中添加褪黑素，可上調(diào)Bcl-2 和下調(diào)Bax 的表達(dá)，促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟以及其孤雌激活后的胚胎發(fā)育[51]。

褪黑素對AKT 抑制有顯著的保護(hù)作用[5]。添加褪黑素顯著阻止了AKT 抑制劑在卵母細(xì)胞成熟過程的抗發(fā)育作用，最終改善了核成熟、卵丘細(xì)胞擴(kuò)張、早期卵裂，和第8 天囊胚的發(fā)育速度。對AKT 基因水平和蛋白水平的檢測結(jié)果顯示，褪黑素和AKT 信號通路之間存在互作效應(yīng)，有利于卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育[5]。

外源性褪黑素還可通過Sirt1/Sod2依賴機(jī)制逆轉(zhuǎn)老化卵母細(xì)胞的表型缺陷，使卵母細(xì)胞Sirt1 及Sod 的蛋白表達(dá)水平上升，降低ROS 水平和DNA 損傷，使PGC1-α的蛋白表達(dá)水平上升，進(jìn)而使ATP5a1等基因的表達(dá)水平上升，增加線粒體拷貝數(shù)，提升線粒體功能[22]。研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可通過SIRT1-MnSOD依賴的途徑延緩小鼠排卵后卵母細(xì)胞老化，為褪黑素在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供分子機(jī)制支持[52]。褪黑素也可誘導(dǎo)衰老小鼠卵母細(xì)胞中Sirt2的表達(dá)，降低H4K16 的乙酰化水平，進(jìn)而促進(jìn)微絲微管連接的建立和減少減數(shù)分裂的缺陷[53]。

哺乳動物的卵母細(xì)胞在MI 前期停留的時(shí)間較長，容易造成DNA 損傷的積累。積累的DNA 損傷會增加卵母細(xì)胞中染色體斷裂、紡錘體異常、線粒體聚集和氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量惡化。褪黑素也可通過加強(qiáng)非同源末端連接（NHEJ）促進(jìn)DNA 修復(fù)，保護(hù)卵母細(xì)胞在早期停滯期間免受DNA 損傷，同時(shí)防止卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂成熟過程中質(zhì)量的惡化，改善小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量[54]。最近，研究者在小鼠視網(wǎng)膜上又發(fā)現(xiàn)了組織特異性應(yīng)答褪黑素的新機(jī)制[55]。由此可見，褪黑素對哺乳動物機(jī)體，以至哺乳動物卵母細(xì)胞的作用機(jī)制是多方面的，還需繼續(xù)展開深入的研究。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，不同物種卵母細(xì)胞在體內(nèi)外成熟過程中，補(bǔ)充適宜濃度的外源性褪黑素可保護(hù)卵母細(xì)胞免受氧化損傷或某些毒素的損害，主要通過降低氧化應(yīng)激水平，減少DNA 的損傷、抑制早期凋亡、維持線粒體功能、改善紡錘體形態(tài)和恢復(fù)微絲微管肌動蛋白的活力及降低卵母細(xì)胞非整倍體的產(chǎn)生幾率，從而提高卵母細(xì)胞的成熟比例和質(zhì)量，進(jìn)而提高精子與卵母細(xì)胞的結(jié)合能力，促進(jìn)早期胚胎的發(fā)育潛力。褪黑素對哺乳動物卵母細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制復(fù)雜多樣，它們可通過多種通路互作，協(xié)同作用，而具體是如何協(xié)同互作發(fā)揮有益調(diào)節(jié)作用的，還需要廣大研究人員不斷探索。