李法喜 ，王瓊 ，段廷玉 ，聶斌 ，封成智

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020；2. 甘肅省生產(chǎn)力促進(jìn)中心，甘肅蘭州730099）

箭筈豌豆（Vicia sativa）是雙子葉植物綱薔薇目豆科野豌豆屬，又名大巢菜、春巢菜、普通巢草、救荒野豌豆等，具耐寒耐旱［1］，適應(yīng)性好［2］，固氮能力強［3］等特性，與其他牧草混播后可提高草地生產(chǎn)力［4］，是一種優(yōu)良的牧草及飼料作物［5］。箭筈豌豆還可用于麥類作物收獲后的套復(fù)種、玉米（Zea mays）前期間作、馬鈴薯（Solanum tuberosum）間作、果樹間作等模式，是生產(chǎn)中使用較為普遍的一類綠肥作物［6］。此外，箭筈豌豆對防止水土流失，穩(wěn)定和改善生態(tài)環(huán)境具有積極的作用［7］，在我國草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用［8］。

在實際生產(chǎn)中，箭筈豌豆的生長受到許多生物和非生物因素的脅迫，其中病害是限制其優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的重要因素之一［9］。炭疽病是近年來箭筈豌豆生產(chǎn)中一種普遍發(fā)生的真菌性病害［10］，主要危害植株葉部、莖部和莢果，嚴(yán)重時導(dǎo)致葉片枯死甚至植株凋亡［11-12］，顯著降低了產(chǎn)量、品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益，限制了箭筈豌豆種植區(qū)農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展。

化學(xué)防治具有操作簡單、見效快、效果顯著等優(yōu)點，目前仍是植物病害防治中一種重要的手段。百菌清和多菌靈均為廣譜性殺菌劑［13-14］，對多種作物的真菌病害具有防治作用。代森錳鋅是一種有機(jī)含硫殺菌劑，具有廣譜性、低毒性、低殘留、多作用位點等特性［15］。吡唑醚菌酯和苯甲·嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是一類高效、低毒、廣譜、內(nèi)吸性殺菌劑［16］。百菌清和多菌靈均對花椒（Zanthoxylum bungeanum）炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）具有較強的抑菌作用［17］。多菌靈和吡唑醚菌酯對苜蓿（Medicago sativa）炭疽?。–olletotrichum linicolais）具有不錯的防治效果［18］。吡唑醚菌酯可以有效抑制毀滅刺盤孢（Colletotrichum destructivum）的菌絲生長，從而有效防治苜蓿炭疽?。?9］。代森錳鋅能有效防治淮山（Dioscorea opposite）炭疽病，防效可達(dá) 79.63%［20］，并可有效抑制辣椒（Capsicum annuum）炭疽病菌的生長［21］。苯甲·嘧菌酯對西瓜（Citrullus lanatus）炭疽病（Colletotrichum lagenarium）［22-23］和山藥（Dioscorea oppositifolia）炭疽?。?4］均有很好的防效。

國內(nèi)外尚無箭筈豌豆炭疽病化學(xué)防治的相關(guān)研究報道。因此，篩選出對菠菜炭疽菌（Colletotrichum spinaciae）具有良好抑制效果的化學(xué)藥劑，對于箭筈豌豆炭疽病，尤其是種子田該病害的防治具有重要意義。本研究選用75%百菌清、50%多菌靈、80%代森錳鋅、25%吡唑醚菌酯和32.5%苯甲·嘧菌酯5 種化學(xué)藥劑，擬通過殺菌劑室內(nèi)毒力測定、溫室盆栽防病試驗和田間防治試驗篩選出對箭筈豌豆炭疽病防效較好的藥劑，以期為實際生產(chǎn)中箭筈豌豆炭疽病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原菌自甘肅夏河箭筈豌豆炭疽病病葉中分離得到，經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和致病性測定將病原菌鑒定為菠菜炭疽菌，保存在25 ℃冰箱中備用。5 種供試藥劑信息見表1。

表1 供試藥劑及使用濃度Table 1 Characteristics and concentrations of the five fungicides

1.2 不同殺菌劑對箭筈豌豆炭疽病菌的室內(nèi)毒力測定

將配置好的不同濃度溶液制成不同濃度的平板（1 藥劑∶9 PDA 培養(yǎng)基），對照為等量的無菌水。將5 mm 的菌餅置于平板中央，25 ℃下黑暗培養(yǎng)，20 d 后用“十字交叉法”［18］測量菌落直徑，計算抑菌率，每處理重復(fù)5 次。根據(jù)各藥劑處理濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑菌率值為縱坐標(biāo)建立毒力回歸方程Y=a+bX，計算各藥劑的相關(guān)系數(shù)和半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）。

1.3 殺菌劑及其復(fù)配對箭筈豌豆炭疽病的盆栽抑制試驗

根據(jù)其殺菌機(jī)理不同按1∶1、1∶2、2∶1 的母液質(zhì)量比將室內(nèi)毒力測定中抑菌效果較好的3 種藥劑兩兩配制，加上單獨使用的3 種藥劑和對照，共13 個處理：50%多菌靈（J1）、25%吡唑醚菌酯（J2）、32.5%苯甲·嘧菌酯（J3）、J1∶J2、J1∶2J2、2J1∶J2、J1∶J3、J1∶2J3、2J1∶J3、J2∶J3、J2∶2J3、2J2∶J3、無菌水（CK）。箭筈豌豆采用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部主推品種蘭箭2 號，在溫室種植4 周后，用滅菌后的載玻片刮取生長30 d 的病原物，過濾后配制成1×106個·mL-1的孢子懸浮液采用刺傷噴霧法［11］接種到箭筈豌豆植株上，每盆接種量為200 mL，用黑色塑料袋套袋48 h。接種3 d 后進(jìn)行噴藥處理，每處理4 次重復(fù)。接種7 d 后箭筈豌豆開始發(fā)病，施藥14 d 后調(diào)查病情指數(shù)，根據(jù)箭筈豌豆病斑占葉面積的百分比來進(jìn)行病害分級［11］：代表值 0（1 級），無病斑；代表值 1（2 級），病斑占葉面積1%～10%；代表值2（3 級），病斑占葉面積11%～25%；代表值3（4 級），病斑占葉面積26%～50%；代表值4（5 級），病斑占葉面積51%～75%；代表值5（6 級），病斑占葉面積76%～100%。再根據(jù)病情指數(shù)計算藥劑的相對防效、理論防效和增效系數(shù)（SR）。植株收獲時測定箭筈豌豆植株株高、根長、生物量等生長指標(biāo)。

式中：C1，C2表示兩種藥劑單獨施用時的相對防效；若SR=1，表明2 種殺菌劑有加和作用；SR＞1，表明2 種殺菌劑有增效作用；SR＜1，表明 2 種殺菌劑有拮抗作用［25］。

1.4 殺菌劑對箭筈豌豆炭疽病的田間防效試驗

試驗地選自甘肅省甘南藏族自治州夏河縣達(dá)麥鄉(xiāng)山塘村。夏河縣地處青藏高原東北部，在甘南藏族自治州西北部（35.22° N，102.69° E，2733 m），屬于高寒濕潤型氣候區(qū)［26］，年均溫2.8 ℃，無霜期56～105 d，年均降水量516 mm，年均蒸發(fā)量 1262.50 mm［27］。

蘭箭2 號播種量為12.05 g·m-2，條播，行距為20 cm，播深2～3 cm。2019 年7 月上旬，田間自然發(fā)病，各小區(qū)發(fā)病時間一致，病害發(fā)生 10 d 左右，選取50% 多菌靈（J1）、25%吡唑醚菌酯（J2）、32.5%苯甲·嘧菌酯（J3）3 種化學(xué)藥劑在發(fā)病較均勻的小區(qū)內(nèi)，對處于盛花期的箭筈豌豆進(jìn)行殺菌劑噴施試驗，清水作為對照，每種處理3 個重復(fù)，共12 個小區(qū)，小區(qū)面積4.0 m × 5.0 m，小區(qū)間距0.50 m，區(qū)組間距0.50 m。種植前進(jìn)行翻耕，試驗期間不灌溉，不施肥，出苗后人工除草2 次。試驗藥劑用量為50%多菌靈375 g·hm-2，每小區(qū)用水0.50 L；25%吡唑醚菌酯225 g·hm-2，每小區(qū)用水1 L；32.5%苯甲·嘧菌酯150 g·hm-2，每小區(qū)用水0.60 L。噴藥14 d 后調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)［11］，并計算相對防效，計算方法同1.3。

植株收獲時計算小區(qū)箭筈豌豆草產(chǎn)量和種子產(chǎn)量。每小區(qū)選擇3 個樣方（50.0 cm×50.0 cm）進(jìn)行測定，將樣方內(nèi)的箭筈豌豆植株剪下后，在105 ℃下殺青20 min，然后在80 ℃下烘干至恒重后稱重，換算為每hm2干草產(chǎn)量。將樣方中的種子放入布袋，晾干后人工脫粒稱重，換算為每hm2種子產(chǎn)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 處理所有數(shù)據(jù)，利用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，用最小顯著性差異法（leastsignificant difference，LSD）進(jìn)行顯著性檢驗，并利用GraphPad Prism 5.01 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌劑對菠菜炭疽菌的室內(nèi)毒力測定

供試的5 種殺菌劑對菠菜炭疽菌的生長都有抑制作用，總體上濃度越高抑菌效果越強（表2 和圖1）。除 31.25 mg·L-1的 75% 百 菌 清 和 31.25 mg·L-1的80%代森錳鋅外，其余濃度的各類殺菌劑中菌落直徑均顯著低于對照（P＜0.05），且濃度越高菌落直徑越小。J2和J3的抑菌效果較好，抑菌率最高分別可達(dá)79.90%和79.01%，顯著高于75%百菌清和80%代森錳鋅（P＜0.05）；百菌清和代森錳鋅的抑菌率較差，最低分別為9.97%和8.98%，顯著低于J3、J2和J（1P＜0.05）（表 2）。

表2 5 種殺菌劑對菠菜炭疽菌的抑菌作用Table 2 Antibacterial effect of five fungicides on C.spinaciae

毒力測定結(jié)果表明，5 種藥劑對菠菜炭疽菌的毒力從大到小依次為J3＞J2＞J1＞80%代森錳鋅＞75%百菌清。J3的抑菌效果最好，EC50值為 11.27 mg·L-1；其次為 J2和 J1，EC50值分別為 12.15 和 30.78 mg·L-1，對病原菌也有較強的毒力作用；80%代森錳鋅和75%百菌清的 EC50值較大，分別 277.58 和 528.10 mg·L-1，抑菌效果較差（表3）。

表3 5 種殺菌劑對菠菜炭疽菌的毒力Table 3 Toxicity of five fungicides on C.spinaciae

2.2 盆栽條件下殺菌劑及其復(fù)配對箭筈豌豆炭疽病抑制效果

3 種殺菌劑及其復(fù)配使箭筈豌豆炭疽病的發(fā)病率和病情指數(shù)均有不同程度的降低。2J1∶J2處理下的發(fā)病率和病情指數(shù)最低，分別為20.00%和11.50，均顯著低于對照（P＜0.05），相對防效可達(dá)68.71%，顯著高于3 種藥劑單獨施用以及J2∶2J3處理。J1和J2在3 種復(fù)配比例下的增效系數(shù)均大于1，說明這兩種藥劑復(fù)配后對箭筈豌豆炭疽病具有增效作用。J1和J3則需在合適的復(fù)配比例下才具有增效作用，而J2和J3這兩種藥劑復(fù)配后具有拮抗作用，因此不適合復(fù)配施用（表4）。

表4 3 種藥劑及復(fù)配對箭筈豌豆炭疽病的抑制效果Table 4 Inhibitory effect of 3 fungicides and their compound formulations on common vetch anthracnose

盆栽條件下，J1、J2和J3三種殺菌劑單施及復(fù)配處理下箭筈豌豆的株高無顯著差異（P＞0.05）（圖2）。J1∶2J3處理下，箭筈豌豆的根長最長，達(dá)24.4 cm，相比對照增加了48.60%（P＜0.05）（圖3）；與對照相比，2J1∶J3處理下對植株的地上生物量提升幅度最大，為51.30%（P＜0.05）（圖4）。J1∶2J2處理以及2J2∶J3處理下地下生物量較大，相比對照均增加了43.00%（P＜0.05）（圖5）。結(jié)果表明，3 種殺菌劑單施及復(fù)配對箭筈豌豆的生長均有一定的促進(jìn)作用。相比于對照，J1∶2J2、2J1∶J3以及 2J2∶J3處理下地上及地下生物量均顯著高于對照（P＜0.05）。

圖2 箭筈豌豆在不同處理下的株高Fig.2 Plant height of V. sativa under different treatments

圖3 箭筈豌豆在不同處理下的根長Fig.3 Root length of V. sativa under different treatments

圖4 箭筈豌豆在不同處理下的地上生物量Fig.4 Aboveground biomass of V. sativa under different treatments

圖5 箭筈豌豆在不同處理下的地下生物量Fig.5 Underground biomass of V. sativa under different treatments

2.3 殺菌劑對箭筈豌豆炭疽病的田間防效

噴施3 種殺菌劑均可有效防治箭筈豌豆炭疽病。與對照相比，J1、J2和J3處理下的病害病情指數(shù)分別顯著降低了 20.56%、68.97% 和 63.53%（P＜0.05）。不同殺菌劑對箭筈豌豆炭疽病的防治效果存在差異。J2（有效劑量為225 g·hm-2）防效最好，達(dá)68.88%，其次為J3（有效劑量為150 g·hm-2），達(dá)63.50% ，均顯著高于J1（有效劑量為375 g·hm-2）20.62%的相對防效（P＜0.05）（表 5）。

表5 田間條件下殺菌劑對箭筈豌豆炭疽病的防治效果Table 5 Control effects of fungicides on common vetch anthracnose under field conditions

3 種殺菌劑均可減輕炭疽病的危害，提高箭筈豌豆的草產(chǎn)量和種子產(chǎn)量。箭筈豌豆在J3處理下的草產(chǎn)量最高，為5525.30 kg·hm-2，與對照相比增加了25.80%（P＜0.05）；箭筈豌豆種子產(chǎn)量在J2和J3處理下分別較CK 顯著增加了32.50%和25.90%（P＜0.05）（圖6）。表明J3和J2對箭筈豌豆的增產(chǎn)作用較J1好。

圖6 殺菌劑對箭筈豌豆草產(chǎn)量和種子產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of fungicides on the grass yield and seed yield of V. sativa

未噴施殺菌劑的小區(qū)（CK）中箭筈豌豆遭到炭疽病的嚴(yán)重危害，植株大面積凋亡。噴施3 種殺菌劑均能有效防治箭筈豌豆炭疽病，以J2效果最為顯著，大部分植株均能維持正常狀態(tài)（圖7）。

圖7 不同殺菌劑處理下的箭筈豌豆田間表現(xiàn)Fig.7 The field performance of V. sativa under different treatments

3 討論

殺菌劑主要通過破壞病原菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抑制其正常生長和代謝來實現(xiàn)殺菌作用。本研究通過室內(nèi)毒力測定試驗發(fā)現(xiàn)5 種藥劑均可抑制箭筈豌豆炭疽病菌的生長，它們的毒力從大到小依次為J3＞J2＞J1＞80%代森錳鋅＞75%百菌清。其中J3和J2的抑菌效果較好，EC50值分別為11.27 和12.15 mg·L-1，其次為50%多菌靈，EC50值為30.78 mg·L-1。吡唑醚菌酯和苯甲·嘧菌酯均屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，這類殺菌劑的殺菌譜非常廣泛，它們通過阻塞細(xì)胞色素之間的電子傳遞，干擾真菌體內(nèi)的能量循環(huán)，從而抑制線粒體的呼吸，達(dá)到抑菌殺菌的作用［16，28］。研究發(fā)現(xiàn)，吡唑醚菌酯可顯著抑制紫花苜蓿炭疽菌菌絲生長，EC50為 0.39 mg·L-1［19］，亦可顯著抑制葡萄炭疽病菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長，EC50小于1.00 mg·L-1［29］。此外，25% 吡唑醚菌酯對紅麻炭疽病菌（Colletotrichum indicum）［30］和梨炭疽病菌［31］也表現(xiàn)出了良好的抑制效果，EC50均小于 0.50 mg·L-1。多菌靈可以干擾病原菌有絲分裂中紡錘體的形成，影響細(xì)胞分裂，起到殺菌作用；也有報道稱多菌靈可以抑制病原菌對碳和磷元素的利用，達(dá)到殺菌的目的［32］。馬甲強等［18］對苜蓿炭疽病菌進(jìn)行了殺菌劑室內(nèi)毒力測定，發(fā)現(xiàn)98.1%多菌靈對炭疽病菌的抑制效果較好，EC50值小于1.00 mg·L-1。多菌靈對杧果膠孢炭疽菌［33］、西瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbicalare）［34］以及無花果炭疽病菌［35］的毒力也較強，EC50均小于 2.00 mg·L-1。室內(nèi)毒力測定試驗結(jié)果表明，多菌靈、吡唑醚菌酯和苯甲·嘧菌酯表現(xiàn)出對箭筈豌豆炭疽菌較強的抑制作用，有望作為防治箭筈豌豆炭疽病的有效藥劑。

在生產(chǎn)實踐中，連續(xù)使用同一種（類）殺菌劑，易使病原菌產(chǎn)生抗性，且大多數(shù)情況下，幾種殺菌劑配合使用比單獨使用一種殺菌劑效果更好。例如，相比于使用單一殺菌劑，多菌靈、代森錳鋅和肟菌酯混合使用使扶芳藤（Euonymus fortunei）炭疽病嚴(yán)重度降低了12.10%～35.90%［36］。本研究選取了室內(nèi)毒力測定中對箭筈豌豆炭疽病菌抑制作用較好的3 種藥劑按1∶1、1∶2 和2∶1 復(fù)配，50%多菌靈和25%吡唑醚菌酯不同比例復(fù)配后具有增效作用，且噴施殺菌劑可顯著提高箭筈豌豆的根長和生物量，對箭筈豌豆生長具有促進(jìn)作用。多菌靈與很多殺菌劑復(fù)配，均取得了不錯的防治效果。如多菌靈與吡唑醚菌酯復(fù)配對辣椒炭疽病菌增效系數(shù)（SR）為1.52～2.17，具有顯著增效作用［37］。馬甲強［38］通過殺菌劑復(fù)配對苜蓿炭疽病菌抑制的盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，97.73%咪鮮胺與98.1%多菌靈（2∶1）的增效作用極顯著，SR 為2.97。本試驗研究結(jié)果對于拓展多菌靈、吡唑醚菌酯和苯甲·嘧菌酯的應(yīng)用，延緩化學(xué)殺菌劑的抗性產(chǎn)生，研究開發(fā)防治箭筈豌豆炭疽病的新型復(fù)配劑具有積極的意義。

箭筈豌豆炭疽病的田間防效試驗中，3 種殺菌劑均可減少炭疽病的危害，使箭筈豌豆草產(chǎn)量增加15.9%～25.8%，種子產(chǎn)量增加17.2%～32.5%。吡唑醚菌酯和苯甲·嘧菌酯表現(xiàn)出了更好的防效，25%吡唑醚菌酯（有效劑量為225 g·hm-2）防效最好，防效達(dá)68.88%，其次為32.5%苯甲·嘧菌酯（有效劑量為150 g·hm-2），防效達(dá)63.50%。該結(jié)果與黃樹生等［39］對西瓜炭疽病的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)發(fā)病初期施吡唑醚菌酯和苯甲·嘧菌酯，防效分別為70.67%～72.18%和69.68%～71.26%。眾多研究表明，吡唑醚菌酯對炭疽菌屬引起的炭疽病有很好的抑制效果，表現(xiàn)出了較好的防效。25%吡唑醚菌酯對杧果炭疽病的田間防效為41.14%～48.91%［40］；吡唑醚菌酯對草莓炭疽?。–olletotrichum fructicola）的防效為 66.70%［41］；25% 吡唑醚菌酯（150 g·hm-2）對苜蓿炭疽病菌的防效較好，達(dá)到67.85%，增產(chǎn)51.14%［18］。吡唑醚菌酯能顯著減少炭疽病的危害，在田間表現(xiàn)出良好的增產(chǎn)效果。吡唑醚菌酯降低辣椒炭疽?。–olletotrichum acutatum）嚴(yán)重度41.80%～66.10%，提高產(chǎn)量8.80%～39.60%［42］；吡唑醚菌酯能減少芹菜炭疽病發(fā)病率27.00%～50.00%［43］；吡唑醚菌酯能顯著減輕菜豆炭疽?。–olletotrichum lindemuthianum）對葉片和果莢的危害，提高產(chǎn)量［44］。吡唑醚菌酯和苯甲·嘧菌酯均可作為防治箭筈豌豆炭疽病的推廣藥劑。

25%吡唑醚菌酯和32.5%苯甲·嘧菌酯對箭筈豌豆炭疽病菌菌絲生長的抑制效果較強，溫室條件下對箭筈豌豆炭疽病的防治效果以及田間條件下對箭筈豌豆的增產(chǎn)效果也均優(yōu)于50%多菌靈，且兩種藥劑之間無顯著性差異（P＞0.05）。25%吡唑醚菌酯和32.5%苯甲·嘧菌酯這兩種單獨使用表現(xiàn)較好的藥劑，復(fù)配施用時增效作用較差。盆栽試驗中表現(xiàn)良好的復(fù)配劑，在田間條件下是否依然具有較好的防效還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究首次進(jìn)行了箭筈豌豆炭疽病的化學(xué)防治研究，結(jié)合室內(nèi)毒力測定、溫室盆栽和田間防治試驗，探究了百菌清、多菌靈、代森錳鋅、吡唑醚菌酯和苯甲·嘧菌酯5 種殺菌劑對菠菜炭疽菌的防治效果。發(fā)現(xiàn)32.5%苯甲·嘧菌酯和25%吡唑醚菌酯兩種殺菌劑以及它們和50%多菌靈的復(fù)配劑對炭疽病菌具有較好的抑菌效果及防病作用，兩種殺菌劑的田間防效達(dá)63%以上，可作為箭筈豌豆種子田炭疽病防治藥劑。