汪楠，李巖

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng) 110032）

膽汁反流性胃炎（bile reflux gastritis，BRG），是多種原因引起胃黏膜組織損傷的一種疾病，由于十二指腸胃反流（duodeno gastric reflux，DGR）現(xiàn)象異常增多導(dǎo)致[1]，屬消化內(nèi)科常見(jiàn)疾病之一，其發(fā)生與幽門功能下降、胃竇清除能力降低、十二指腸動(dòng)力異常等因素有關(guān)[2]。這些因素的存在既可增加十二指腸—胃反流，又可導(dǎo)致胃排空延緩，延長(zhǎng)胃黏膜與反流液的接觸時(shí)間，從而加重胃黏膜的損傷。目前，西醫(yī)對(duì)膽汁反流性胃炎的治療主要應(yīng)用促胃動(dòng)力藥、胃黏膜保護(hù)劑及抑酸劑等，多有不同程度的副作用存在，增加了耐藥性及藥物副作用的可能性，故不宜長(zhǎng)期服用。大量臨床實(shí)踐表明，中藥具有療效高、靶點(diǎn)多、副作用小等優(yōu)勢(shì)，更有益于該病的治療。

和胃反流康是我院消化科多年臨床觀察篩選的效方，廣泛應(yīng)用于各類消化性疾病患者的治療，如慢性非萎縮性胃炎、膽汁反流性胃炎、非潰瘍性消化不良等常見(jiàn)疾病。本方具有疏肝利膽、益氣健脾、和胃降逆之功效，大量臨床實(shí)踐證明，和胃反流康具有良好的療效，可以明顯緩解患者胃痛、胃脹、反酸、燒心、嘈雜等癥狀。p38MAPK是MAPKs家族中控制炎癥反應(yīng)最重要的家族成員之一，它可以促進(jìn)白細(xì)胞的聚集和活化，參與轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)節(jié)及細(xì)胞因子的合成，對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用。COX-2是使花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素的關(guān)鍵酶，當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激因素作用時(shí)，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、炎性介質(zhì)等，COX-2的表達(dá)迅速上升，尤其在炎癥區(qū)域表達(dá)顯著上調(diào)。因此，通過(guò)觀察和胃反流康對(duì)大鼠胃黏膜p38MAPK蛋白及胃黏膜細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)的影響，有助于了解其對(duì)胃黏膜炎性損害的改善，具有防止胃黏膜腸上皮化生及不典型增生等癌前病變發(fā)生的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的Wistar大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司購(gòu)買[SCXK（遼）2010-0001]。購(gòu)入后于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)[SYXK（遼）2013-0009]，給予常規(guī)顆粒飼料，室溫（20±2） ℃，相對(duì)濕度45%，12 h晝夜節(jié)律，自由食水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及制備 1）和胃反流康方劑，組成有柴胡15 g，陳皮10 g，白芍10 g，枳殼10 g，香附15 g，炒白術(shù)15 g，茯苓10 g，黃連6 g，蒲公英20 g，半夏10 g，甘草10 g。以上中草藥均于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局購(gòu)買，水煎濃縮，分別制成含量為1.37 g·mL-1、2.73 g·mL-1和5.46 g·mL-1的混懸液；2）嗎丁啉（規(guī)格10 mg），西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：090820214），使用前水煎濃縮，制成含量為2.78 mg·mL-1的混懸液；3）牛磺膽酸鈉（T6510），北京博奧拓達(dá)生物科技有限公司生產(chǎn)；4）胰酶（0458），Amresco公司生產(chǎn)；5）卵磷脂（P5638），sigma公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑 1）Anti-p38MAPK，abcam公司生產(chǎn)；2）HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；3）蛋白提取試劑盒、蛋白marker，杭州碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)；4）ECL發(fā)光試劑盒，Therom公司生產(chǎn)；5）RT-PCR試劑盒，大連寶生物公司生產(chǎn)；6）DNA marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；7）Trizol，Invitrogen生產(chǎn)；8）引物，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司代為合成。

1.1.4 主要儀器及設(shè)備 1）EPS-300型電泳儀、DYCP-40E型電泳槽、4200SF型凝膠成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司生產(chǎn)；2）MyCycler ThermalCycl型梯度PCR儀（BIO-RAD），美國(guó)伯樂(lè)公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 反流液配制 依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[3]，將?；悄懰徕c2.5 g，胰酶1.5 g，卵磷脂0.25 g溶于蒸餾水100 mL中配制成反流液。

1.2.2 分組、造模及給藥 將60只大鼠隨機(jī)分為6組，即空白組、模型組、和胃反流康高、中、低劑量組、嗎叮啉組，每組 10只。除空白組外，其余各組大鼠用配制好的灌流液灌胃造模，給藥體積為15 mL·kg-1，每日1次，連續(xù)35 d?？瞻捉M和模型組給予等容量的蒸餾水灌胃，和胃反流康高、中、低劑量組分別以54.6 g·kg-1、27.3 g·kg-1、13.7 g·kg-1生藥灌胃，嗎叮啉組以2.78 mg·kg-1灌胃，各給藥組自造模開(kāi)始后第2周至第5周造模結(jié)束連續(xù)給藥，每天于造模結(jié)束6 h后灌胃給藥，每日1次[4]。

1.3 取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 胃竇部胃黏膜組織p38MAPK蛋白表達(dá)水平各組大鼠末次給藥前1 d，禁食不禁水24 h，末次給藥后，無(wú)菌操作剖腹取胃，將胃內(nèi)容物用冰生理鹽水漂洗干凈，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃保存?zhèn)溆?。采用western-blot法檢測(cè)各組大鼠胃竇部胃黏膜組織中p38MAPK蛋白表達(dá)水平。凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，測(cè)定條帶灰度值，并以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值作為該例樣本蛋白表達(dá)相對(duì)水平。

1.3.2 胃竇部胃黏膜組織COX-2mRNA表達(dá)水平各組大鼠末次給藥前1 d，禁食不禁水24 h，末次給藥后，無(wú)菌操作剖腹取胃，將胃內(nèi)容物用冰生理鹽水漂洗干凈，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃保存?zhèn)溆?。采用RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠胃竇部胃粘膜組織中COX-2 mRNA表達(dá)水平，取254 nm波長(zhǎng)的紫外燈，仔細(xì)觀察，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，并予以保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析進(jìn)行，以P＜0.01，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p38MAPK蛋白表達(dá)水平

模型組較之于空白組，大鼠胃黏膜組織p38MAPK表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；較之于模型組，和胃反流康高、中、低劑量組及嗎丁啉組大鼠胃黏膜組織中p38MAPK蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）；較之于嗎丁啉組，和胃反流康高劑量組大鼠胃黏膜組織中p38MAPK蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），而和胃反流康中、低劑量組與之比較則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組胃竇部胃黏膜組織中p38MAPK蛋白表達(dá)水平（±s，n = 6）

表1 各組胃竇部胃黏膜組織中p38MAPK蛋白表達(dá)水平（±s，n = 6）

注：與空白組比較，# P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與嗎丁啉組比較，▲P＜0.05

組別p38MAPK空白組0.228±0.062模型組0.739±0.063#和胃反流康高劑量組0.429±0.068 #△▲和胃反流康中劑量組0.479±0.065 #△和胃反流康低劑量組0.569±0.075 #△嗎丁啉組 0.529±0.058 #△

圖1 各組胃黏膜組織p38MAPK蛋白表達(dá)比較

2.2 COX-2mRNA表達(dá)水平

模型組較之于空白組，大鼠胃黏膜組織COX-2mRNA表達(dá)水平明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；較之于模型組，和胃反流康高、中、低劑量組及嗎丁啉組大鼠胃黏膜組織中COX-2mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）；較之于嗎丁啉組，和胃反流康高劑量組大鼠COX-2mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），低劑量組與之比較表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），而中劑量組與之比較則無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組胃竇部胃黏膜組織中COX-2mRNA表達(dá)水平（±s，n = 6）

表2 各組胃竇部胃黏膜組織中COX-2mRNA表達(dá)水平（±s，n = 6）

注：與空白組比較，# P＜0.01；與模型組比較，△ P＜0.01；與嗎丁啉組比較，▲ P＜0.05，▲▲ P＜0.01

組別COX-2mRNA空白組0.258±0.046模型組 0.618±0.061 #和胃反流康高劑量組 0.310±0.030#□▲▲和胃反流康中劑量組 0.435±0.068 #□和胃反流康低劑量組 0.485±0.063# □▲嗎丁啉組 0.415±0.043 #□

圖2 各組胃黏膜組織COX-2mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

在膽汁反流性胃炎形成過(guò)程中，膽汁酸是造成黏膜損傷的最主要因素，胰酶和溶血卵磷脂次之。膽汁酸是膽汁的主要成分，屬親脂性類固醇，其“皂化”特性極強(qiáng)，胃黏膜屏障也因此受損[5]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路在大多數(shù)細(xì)胞中普遍存在，可將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞及其細(xì)胞核內(nèi)，從而引起多種細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期及凋亡等，并與炎癥及其他多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。研究表明，p38MAPK是MAPKs家族中控制炎癥反應(yīng)最重要的家族成員之一，它可以促進(jìn)白細(xì)胞的聚集和活化，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的活性及細(xì)胞因子的合成均有調(diào)節(jié)作用，對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用[7-9]。抑制p38MAPK參與的信號(hào)通路傳導(dǎo)可有效的調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡，降低HP誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞COX-2表達(dá)等[10-13]。COX-2是一種誘導(dǎo)酶，是使花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素的關(guān)鍵酶，正常組織中無(wú)COX-2表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激因素作用時(shí)，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、炎性介質(zhì)等，COX-2的表達(dá)迅速上升，尤其在炎癥區(qū)域表達(dá)顯著上調(diào)，其產(chǎn)物前列腺素（prostaglandins，PGs）可進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄[14]。近年研究表明，COX-2在多種腫瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15-16]。如胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，COX-2表達(dá)升高是的一個(gè)重要因子，在萎縮性胃炎伴有腸上皮化生、不典型增生及早期胃癌的情況下，表達(dá)更是顯著增高[11-12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察和胃反流康對(duì)大鼠胃黏膜p38MAPK蛋白及COX-2mRNA表達(dá)的影響，有助于了解其對(duì)胃黏膜炎性損害的改善，防止胃黏膜腸上皮化生及不典型增生等癌前病變發(fā)生的作用。