譚菊 武彩紅 文潮潮 王萌

摘要 [目的]建立一種更優(yōu)化的STO細胞冷凍保存方法。[方法]STO細胞傳至第3代后，調(diào)節(jié)其濃度至 2.09×105個/mL，開展冷凍保存試驗。Ⅰ組將STO細胞置于4 ℃下平衡，1 h后轉入-20 ℃下，12 h后將其轉至液氮中保存;Ⅱ組將STO細胞裝入已注入250 mL 95%乙醇的降溫器后，立即轉至-70 ℃下，12 h后再將其轉至液氮中保存;Ⅲ組將STO細胞懸液于液氮面上方10 cm處平衡20 min，然后將其緩緩轉至液氮中。同時，設Ⅳ組為對照組，即STO細胞不進行冷凍處理。在液氮中保存30 d后進行解凍，以STO細胞的回收率、存活率和生長情況為研究指標，通過MTT法進行STO細胞凍存效果評價。[結果]經(jīng)冷凍處理后，3種方法STO細胞解凍后回收率和存活率均存在顯著差異（P<0.05）。Ⅱ組細胞解凍后細胞回收率低于Ⅰ組、高于Ⅲ組，但細胞存活率最高（84.91%）。與Ⅰ組和Ⅲ組相比，Ⅱ組STO細胞凍存方法不僅能保證冷凍效果，而且可以回收更多的細胞。Ⅱ組STO細胞復蘇后生長相對緩慢，但STO細胞經(jīng)培養(yǎng)后可恢復至冷凍前的生長狀態(tài)。Ⅰ組和Ⅱ組復蘇后STO細胞的增殖速度較快，且增殖率基本相同，而Ⅲ組細胞的增殖速度較慢。[結論]Ⅱ組STO細胞于-70 ℃冰箱中平衡過夜，再轉移至液氮中超低溫冷凍是較為理想的保存方法。

關鍵詞 STO細胞;冷凍保存;存活率;生長

中圖分類號 Q 813? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）23-0130-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.035

Effects of Different Methods on the Cryopreservation of STO Cells

TAN Ju， WU Cai-hong， WEN Chao-chao et al

（Jiangsu Agri-Animal Husbandry Vocational College，? Taizhou， Jiangsu 225300）

Abstract [Objective]To establish an optimized method for the cryopreservation of STO cells. [Method] After subculture 3 generations， the concentration of STO cells were adjusted to 2.09×105 cells per milliliter， and then the cryopreservation experiment was conducted. STO cells in I group were equalized at 4 ℃， transferred into -20 ℃ after 1 h， and stored in liquid nitrogen after 12 h. STO cells in Ⅱ group were placed in a cooler which had been injected with 250 mL 95% alcohol and then transferred into -70 ℃ immediately， and then transferred to liquid nitrogen for preservation 12 hours later. In Ⅲ group， STO cell suspension was balanced at 10 cm above the liquid nitrogen surface for 20 min， and then it was slowly transferred to liquid nitrogen.? At the same time， Ⅳ group was set as the control group， STO cells were not cryopreserved. After being stored 30 days， STO cells were thawed. The cryopreservation effect of STO cells was evaluated by using MTT method with the recovery rate， survival rate and growth rate as the research indices. [Result] After freezing treatment，? the recovery rate and survival rate of STO cells were significantly different among three different groups （P<0.05）. The recovery rate of STO cells in Ⅱ group was lower than that in I group and higher than that in Ⅲ group， but cell survival rate in Ⅱ group was the highest（84.91%）. Compared with Ⅰ group and Ⅲ group， the method of Ⅱ group could not only ensure the freezing effect， but it could also recover more cells. The growth of STO cells in Ⅱ group was relatively slow after resuscitated， but STO cells in Ⅱ group could return to the growth state before freezing. After resuscitation， the proliferation rate of STO cells in Ⅰ group and Ⅱ group was faster， and the appreciation rate was basically the same， while the proliferation rate of STO cells in Ⅲ group was slower. [Conclusion]The preservation method of group Ⅱ （STO cells were equilibrated overnight in a refrigerator at -70 ℃， and then transferred to? liquid nitrogen for ultra-low temperature freezing） was ideal for the preservation of STO cells.

Key words STO cells;Cryopreservation;Survival rate;Growth

基金項目 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)課題（202012-806077Y）。

作者簡介 譚菊（1978—），女，江蘇句容人，講師，碩士，從事獸醫(yī)臨床研究。

通信作者，教授，博士，從事動物生殖生物學研究。

收稿日期 2021-07-27

胚胎干細胞（ESC）因其具有自我更新能力和多向分化潛能[1]的特點而具有重要的科學價值和應用前景。ESC的自我更新能力可以有效確保其無限增殖和多向分化潛能[2]。在體外，若ESC要維持自我更新的能力，則必須有飼養(yǎng)層或其他分化抑制物的支持[3]，否則ESC發(fā)生分化，其多向分化潛能會消失[4]。其中，飼養(yǎng)層細胞是建立和維持ESC細胞系的必要條件[5]。目前，原代小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）和鼠胚成纖維細胞系（STO）2種細胞最常被用作飼養(yǎng)層細胞。STO是已建成的細胞系，可進行多次傳代，便于使用[6]。但是，STO細胞株作為連續(xù)細胞系，缺乏遺傳穩(wěn)定性，在連續(xù)傳代過程中容易發(fā)生變異[7]。對遺傳相對穩(wěn)定的未變異STO細胞株進行有效保存是防止STO細胞發(fā)生變異的有效方法。

低溫保存是生物樣本最常用的保存方法[8]。常規(guī)慢速冷凍已被廣泛應用于細胞保存[9-10]。從理論上看，在超低溫（-196 ℃）冷凍狀態(tài)下細胞的代謝活動幾乎完全停止，因此生物技術領域常用該方法長期保存細胞[11]。筆者以STO細胞為研究對象，探索不同冷凍方法對其保存效果的影響，旨在篩選相對穩(wěn)定、效果好、操作簡易可行、經(jīng)濟的飼養(yǎng)層細胞凍存方法。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

小牛血清（NCS，Gibco）、DMEM培養(yǎng)液（Gibco）、磷酸鹽緩沖液（PBS，上海生工）、二甲基亞砜（DMSO，Gibco）、臺盼藍（TB，上海生工）、噻唑藍（MTT，上海生工）、STO 細胞均由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院實驗室凍存。

1.2 主要試劑的配制

1.2.1 STO細胞培養(yǎng)液的配制。

將小牛血清于56 ℃下水浴加熱30 min滅活，過濾除菌、分裝;將90 mL DMEM培養(yǎng)液和10 mL滅活的小牛血清按9∶1混合，即為含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于4 ℃冰箱中保存，用于STO細胞的培養(yǎng)。

1.2.2 冷凍液的配制。

將二甲基亞砜與STO培養(yǎng)液按1∶9混合，吹打混勻?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 MTT試劑的配制。

稱取一定量的MTT粉溶解于PBS緩沖液（pH 7.4）中，制成5.0 mg/mL的MTT溶液，用0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃下密封避光保存。

1.2.4 臺盼藍染色液的配制。

稱取一定量的臺盼藍（TB）粉溶于0.9%氯化鈉溶液中，配制成0.4%的臺盼藍試劑，4 ℃下密閉保存。

1.3 主要方法

1.3.1 STO細胞解凍和培養(yǎng)。

將STO細胞冷凍-解凍后，加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至細胞匯合度為80%左右時加入含10 ng/mL絲裂霉素的DMEM培養(yǎng)液作用2.5 h;將1.75×105個/孔的STO 細胞置于用0.1%明膠預處理30 min的4孔板中，于CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，使其貼壁[12-13]。

1.3.2 STO細胞計數(shù)和存活率測定。

采用臺盼藍染色方法對冷凍前后的STO細胞進行總細胞計數(shù)和存活率測定。TB染色后，死細胞呈藍綠色，活細胞未著色。

1.3.3 MTT法測定細胞活力。

經(jīng)冷凍-解凍的STO細胞用DMEM培養(yǎng)液進行重懸，在經(jīng)明膠預處理的96孔酶標板內(nèi)加入200 μL重懸液，每孔4×103個，然后置于5% CO2培養(yǎng)箱中;分別培養(yǎng)12、24、48、72、96和120 h后，使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定[12]。

1.4 試驗設計

STO細胞傳代至第3代，調(diào)節(jié)其濃度至 2.09×105個/mL，開展冷凍保存試驗。試驗分為4組：Ⅰ～Ⅲ組為冷凍試驗組，Ⅰ組將STO細胞在4 ℃下平衡1 h后轉入-20 ℃下12 h，然后將其轉至液氮中保存;Ⅱ組將STO細胞懸液裝入已注入250 mL 95%乙醇的降溫器中后，立即轉至-70 ℃下12 h，然后將其轉至液氮中保存;Ⅲ組將裝有STO細胞懸液的安瓿管置于液氮面上方10 cm處平衡20 min，然后將其緩緩沉入液氮中。30 d后，檢查凍存效果。Ⅳ組為對照組，STO細胞不進行冷凍處理。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 STO細胞凍后回收率和存活率

STO細胞在液氮中保存30 d后，于37 ℃解凍后復蘇3 min，復蘇后的細胞總數(shù)及解凍后STO細胞存活率見表1。

由表1可知，經(jīng)3種冷凍方法處理后，STO細胞解凍后回收率和存活率均存在顯著差異（P<0.05）。Ⅱ組STO細胞解凍后回收率低于Ⅰ組、高于Ⅲ組，但細胞存活率最高（84.91%）。這說明Ⅱ組STO細胞凍存方法較Ⅰ組和Ⅲ組凍存方法能更好地保證冷凍效果，且可以回收更多的細胞。

2.2 STO細胞凍后的生長

2.2.1 復蘇STO細胞的形態(tài)學觀察。

與Ⅳ組未經(jīng)冷凍處理的STO細胞相比，Ⅱ組凍存STO細胞復蘇后生長緩慢。Ⅱ組和Ⅳ組STO細胞接種培養(yǎng)結果如圖1所示。從圖1可以看出，Ⅱ組第0代細胞接種后的前幾天培養(yǎng)的STO細胞生長速度較慢;傳代接種3 h后Ⅳ組細胞已經(jīng)有拉長鋪展、貼壁的現(xiàn)象，且核膜核仁逐漸清晰（圖1A），而Ⅱ組細胞則在培養(yǎng)6 h后開始出現(xiàn)貼壁、細胞分裂的現(xiàn)象（圖1D）;Ⅳ組細胞傳代接種12 h后50%以上呈典型的纖維細胞形狀，而Ⅱ組細胞在接種48 h后才出現(xiàn)此現(xiàn)象;Ⅳ組細胞傳代接種5 d后細胞貼壁展開面積占培養(yǎng)瓶底面積的90%以上，而Ⅱ組細胞貼壁展開面積不足培養(yǎng)瓶底面積的60%，且細胞質(zhì)內(nèi)可見微小空泡，細胞核周圍顆?；幻黠@。

2.2.2 冷凍復蘇前后STO細胞的生長曲線。

STO細胞經(jīng)冷凍、復蘇后繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72、96和120 h進行MTT法測定，根據(jù)獲得的OD值繪制生長曲線，見圖2。由圖2可知，冷凍保存30 d后，Ⅰ組和Ⅱ組STO細胞的增殖速度較快，且增殖率基本相同，而Ⅲ組STO細胞的增殖速度較慢。究其原因，一方面，在冷凍過程中低溫和冷凍保護劑等因素對細胞有一定的傷害、刺激作用;另一方面，由于Ⅲ組細胞回收率低，復蘇后細胞接種密度小，因而影響了細胞生長。

3 討論

在低溫冷凍條件下處于懸浮狀態(tài)的細胞能長期保存，對人類和動物生殖醫(yī)學研究、臨床應用及種質(zhì)資源保護均發(fā)揮著重要作用[14]。STO 細胞作為飼養(yǎng)層時，可分泌干細胞生長因子，從而發(fā)揮維持干細胞多能性的作用，因此STO細胞被廣泛應用于人類和動物胚胎干細胞研究[13]。筆者比較了3種不同冷凍方法對STO細胞保存效果的影響，結果表明Ⅱ組STO細胞于-70 ℃冰箱中平衡過夜，再轉移至液氮中超低溫冷凍是較為理想的保存方法。復蘇后，STO細胞雖然在培養(yǎng)前2 d受活力的恢復、生長環(huán)境的適應以及接種密度等因素的影響，出現(xiàn)生長相對緩慢的情況，但仍可在2 d內(nèi)恢復至冷凍前細胞的生長狀態(tài)。這說明Ⅱ組所用的冷凍方法對于保存STO細胞是有效的。

采用Ⅱ組的冷凍方法保存STO細胞取得了較好的冷凍效果，其原因主要在于Ⅱ組在保存過程中降溫過程較I組和Ⅲ組相對穩(wěn)定。Ⅱ組所用的降溫器預先加入250 mL 95%的乙醇，可以延緩降溫速度，使降溫速度保持在1 ℃/min左右[7]，保護細胞不會因降溫速度過快而使胞內(nèi)水分滲出[15]，避免胞內(nèi)產(chǎn)生大量冰晶;同時，也不會因為降溫速度過慢而促使胞內(nèi)外形成冰晶。若冷凍時導致胞內(nèi)有冰晶產(chǎn)生，隨著溫度的進一步降低，胞內(nèi)冰晶的體積隨之膨脹，會導致細胞骨架損傷和DNA損傷，進而造成細胞死亡;同時，冰晶也會導致細胞內(nèi)的酶和蛋白質(zhì)發(fā)生改變[15]。當胞外冰晶過多時，則容易引起胞外電解質(zhì)濃度驟變，從而對細胞造成溶質(zhì)損傷[16]。-70 ℃的超低溫冰箱用途相對簡單、控溫能力強，可避免因反復開關使用而導致其內(nèi)溫度發(fā)生明顯改變。另外，Ⅱ組冷凍保存操作步驟相對簡單，細胞無需多次轉移后再投入液氮中，減少了每次轉移過程中由于溫度急劇變化而造成的細胞損傷[7]。

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