楊昊虹，宋更選，王慧琳，孫志霞，王琳璇，謝惠春

(青海師范大學 青藏高原藥用動植物資源青海省重點實驗室，青海 西寧 810008)

高脂血癥是誘發(fā)動脈粥樣硬化(AS)的重要因素，它可引起血管內(nèi)皮功能障礙形成泡沫細胞，進而促進AS的發(fā)生[1].研究證實，中藥在降血脂方面具有重要作用.近年來，研究發(fā)現(xiàn)中藥大黃有效活性成分主要由蒽醌及其衍生物、苷類化合物、鞣質(zhì)類、花青素類、多糖等組成[2]，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)胃腸功能、抗炎、保肝及抗衰老以及降血脂等藥理作用[3-7].大黃總蒽醌(Rhubarb Total Anthraquinones，RTA)作為大黃主要活性成分，包含大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚及其葡糖糖苷等成分[8].目前，許多學者對大黃總蒽醌成分分離及提取做了大量研究[9-10]，表明大黃總蒽醌類成分具有廣泛的生物活性和改善肝臟、心血管以及血脂的作用[11-14].因此，本文選用不同劑量的唐古特大黃總蒽醌提取物，研究其對高脂大鼠血脂以及動脈粥樣硬化的影響，為探究唐古特大黃總蒽醌在降血脂與預(yù)防動脈粥樣硬化的作用機制提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD大鼠，3月齡，體重220±20g，購自青海省西寧市地方病研究所，許可證號：醫(yī)動字第14-002和14-003號.

1.2 試劑及儀器

大黃素對照品(Emodin)，批號為0431k3505(sigma公司)；膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒(寧波瑞源生物科技有限公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(中生北控生物科技有限公司)；C-反應(yīng)蛋白(CRP)(山東3V生物工程集團)；鈣(Ca2+)測定試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)；中藥粉碎機(山東臨清宏源制藥設(shè)備有限公司)；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠)；美國貝克曼AU2700全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)；輪轉(zhuǎn)精密切片機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；KD-T電腦生物組織攤烤片機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；Nikon ECLIPSE 50i顯微鏡(日本尼康公司).

1.3 藥材及實驗藥物

唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.ex Regel.)采集自青海省果洛藏族自治州，經(jīng)青海師范大學曾陽教授鑒定.

唐古特大黃總蒽醌提取物由前期制備，參照前人[15]方法利用大黃素為對照品繪制標準曲線，計算回歸方程，再利用紫外分光光度法測定大黃總蒽醌含量，最終唐古特大黃總蒽醌回收率為3.05%.

2 方法

2.1 分組及處理

將大鼠隨機分為空白對照組、陽性對照組、模型對照組、唐古特大黃總蒽醌提取物高、中、低劑量組，每組10只.除空白對照組外，其余各組大鼠一次性腹腔注射維生素D3(300000IU·kg-1)后，每日飼以高脂飼料(81.3%基礎(chǔ)飼料、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油)以構(gòu)建高脂大鼠.各組于造模第6周開始灌胃給藥，連續(xù)4周.其中，空白對照組組與模型對照組平行給予同體積生理鹽水，陽性對照組灌胃辛伐他汀4.5mg·kg-1·d-1，總蒽醌提取物高、中、低劑量組分別灌胃大黃總蒽醌1.190g·kg-1·d-1、0.396g·kg-1·d-1和0.132g·kg-1·d-1.

2.2 檢測指標及方法

2.2.1 觀察大鼠的體重、飲食、排便等一般精神狀況

2.2.2 血脂及生化指標測定

末次給藥后大鼠禁食12h，心臟取血，離心后取上清液分別測定膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)以及鈣(Ca2+)含量.

2.2.3 組織病理檢測

剖腹取大鼠肝臟，清洗血跡并用濾紙吸盡表面水分，精確稱重計算肝指數(shù).隨后，切取肝臟固定于10%福爾馬林液，石蠟包埋，采用HE常規(guī)染色，光鏡下觀察組織病理變化情況.

取各組大鼠胸主動脈制作切片，用光學顯微鏡進行病理組織學檢查，觀察各組病變情況.

2.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學處理，結(jié)果用平均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示.兩樣本均數(shù)間采用T檢驗進行顯著性分析，多樣本采用ANOVA單因素方差分析處理.P<0.05有顯著性差異，P<0.01有極顯著性差異，P>0.05為無顯著性差異.

3 結(jié)果與分析

3.1 各組大鼠體重變化

實驗初期，各組大鼠整體狀態(tài)及飲食量并無明顯變化，模型組體重變化略高于空白對照組.第6周大黃總蒽醌提取物灌胃后，給藥各組體重隨劑量增加均呈不同程度的下降，尤以大黃總蒽醌高劑量組下降最為明顯.模型組于第8周左右時出現(xiàn)行動欠活潑、精神萎靡、進食量減少等癥狀，體重也有所下降，各組體重變化見表1.

表1 各組大鼠體重變化表(n=10，Mean±SD)

續(xù)表

3.2 各組血脂及生化指標比較

結(jié)果表明(表2)，大黃總蒽醌各劑量組以及陽性對照組TC、TG、LDL-C極顯著(P<0.01)低于模型組但均高于空白組，其中尤以大黃總蒽醌高劑量組降低最為顯著.與模型組相較，給藥各組HDL-C均有不同程度的升高，然而均極顯著(P<0.01)低于空白組，大黃總蒽醌高劑量組升高至空白組同一水平.

表2 唐古特大黃總蒽醌對大鼠血脂水平的影響(n=10，Mean±SD)

測定結(jié)果表明(表3)，模型組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、ALP指標均升高(P<0.01).與模型組比較，大黃總蒽醌各劑量組各項指標隨著蒽醌劑量的增加呈下降趨勢，其中大黃總蒽醌高劑量效果優(yōu)于陽性對照組，能夠極顯著降低ALT、AST、ALP指標.

表3 唐古特大黃總蒽醌對大鼠肝臟生化指標的影響(n=10，Mean±SD)

陽性組、大黃總蒽醌高、中劑量組CRP較模型組極顯著降低(P<0.01)，大黃總蒽醌中劑量組低于陽性組和大黃總蒽醌高劑量組，而大黃總蒽醌低劑量組并無顯著性差異.與模型組相較，陽性對照組、大黃總蒽醌低劑量組血Ca2+值不具有統(tǒng)計學意義，各劑量組血Ca2+隨著總蒽醌劑量的增加呈下降趨勢，尤以高劑量血降Ca2+極顯著(P<0.01)，見表4.

表4 唐古特大黃總蒽醌對大鼠Ca2+和CRP的影響(n=10，Mean±SD)

3.3 各組大鼠組織病理變化

大鼠肝指數(shù)結(jié)果顯示(表5)，給藥組大鼠肝系數(shù)隨著大黃蒽醌濃度呈正相關(guān)，其中大黃總蒽醌高劑量肝指數(shù)與模型組相比較具有顯著性差異(P<0.05)，大黃總蒽醌低劑量組不具顯著性差異.

表5 各組大鼠肝系數(shù)比較(n=10，Mean±SD)

光鏡檢查結(jié)果顯示(圖1)，模型組(B)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞腫脹，核仁擠壓至邊緣且核膜增厚，同時細胞間隙出現(xiàn)膽汁淤積現(xiàn)象，肝組織可見明顯脂肪變性.與模型組相較，各給藥組均有不同程度好轉(zhuǎn)，脂肪變性減弱，脂滴減少，未出現(xiàn)明顯膽汁淤積現(xiàn)象，其中大黃總蒽醌高劑量組(F)病變顯著減輕，中劑量組(E)和低劑量組(D)差異不大，然而各給藥組相對于正常對照組肝細胞腫大，核膜增厚清晰可見.

主動脈組織學形態(tài)檢查結(jié)果見圖2，空白組大鼠(A)胸主動脈內(nèi)膜、中膜和外膜結(jié)構(gòu)完整且清晰可見，未見異常改變.模型組(B)內(nèi)皮下有大量泡沫細胞堆積以及脂質(zhì)堆積，中膜平滑肌細胞有不同程度的萎縮，內(nèi)膜表面纖維組織增生，具有明顯的病變形態(tài).大黃總蒽醌高劑量組(F)血管內(nèi)膜明顯變薄且厚度大致均一，結(jié)構(gòu)完整，彈性內(nèi)膜連續(xù)，表面光滑，在中膜層中彈性膜連續(xù)無斷裂，平滑肌環(huán)形緊湊排列，平滑肌細胞形態(tài)和大小正常且分布均勻，與中、低劑量組(E、D)相比主動脈病變稍輕，無病變的主動脈壁、內(nèi)膜、中膜、外膜均清晰可見，各層結(jié)構(gòu)正常，且內(nèi)皮細胞下有泡沫細胞明顯少于中、低劑量組，因此大黃總蒽醌高劑量組的藥效更為突出.

注：圖中箭頭所指為泡沫細胞圖2 不同處理組胸主動脈組織形態(tài)學變化(×400)

4 討論

高脂血癥是誘發(fā)動脈粥樣硬化(AS)的重要因素[16].研究結(jié)果表明，血漿中TC、TG水平升高，與LDL結(jié)合后形成LDL-C轉(zhuǎn)運至動脈管壁，造成脂質(zhì)沉積引起慢性炎癥反應(yīng)加速AS的發(fā)展[17].然而，HDL-C含量與AS形成呈負相關(guān)，能夠抵制動脈粥樣硬化的形成.因此，改善脂質(zhì)代謝是預(yù)防AS形成的一個關(guān)鍵因素.本研究結(jié)果表明，唐古特大黃總蒽醌提取物干預(yù)后，大鼠TC、TG、LDL-C的含量減少，HDL-C含量升高，尤以高劑量組效果最為顯著，這與前人研究結(jié)果一致[18-20]，說明大黃總蒽醌能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝進而改善AS的形成，但是其作用存在劑量效應(yīng)性.

AS的發(fā)生往往伴隨著脂肪肝等肝臟疾病的出現(xiàn)，脂肪過度攝入導致體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂甚至造成肝損傷，因此脂肪堆積在肝臟，影響肝細胞的功能造成結(jié)締組織增生，最終導致肝硬化.AS通常會導致體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，甚至會導致脂肪肝.長期高脂食物的攝入導致肝臟脂肪變性，引起肝臟代謝功能異常，從而促進AS的形成.本研究中，高脂飲食導致模型組大鼠血脂、膽固醇水平增高，造成肝組織損傷，導致肝細胞脂肪變性及點狀壞死，致使血清AST、ALT和ALP顯著升高.從表3中發(fā)現(xiàn)，大黃總蒽醌能明顯改善AST、ALT、ALP水平，減輕高脂飲食造成的肝損害，間接說明了對肝細胞的保護作用，且組織切片結(jié)果顯示大黃總蒽醌從改善肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細胞形態(tài)、脂肪變性程度等方面對肝臟進行保護，說明大黃總蒽醌對脂質(zhì)代謝紊亂所引起的脂肪肝有較好改善作用，從而進一步預(yù)防AS的發(fā)病.

血鈣升高可誘發(fā)高鈣血癥[21]，高鈣血癥與高脂血癥協(xié)同會造成動脈管壁受損，引起脂蛋白滲透內(nèi)膜，進而誘發(fā)AS斑塊[22].本實驗中，與高脂模型組相較，大黃總蒽醌給藥組的血鈣含量降低，這一結(jié)果證明了大黃總蒽醌有一定的清除血鈣的能力，從而抑制血管鈣化.除此之外，大量實驗證明炎癥細胞因子也是導致AS的一個關(guān)鍵原因[23].CRP作為炎癥敏感性指標，其含量與AS的形成呈正相關(guān).本研究中，大黃總蒽醌給藥組以及陽性組的CRP值極顯著(P<0.01)低于模型組，說明大黃總蒽醌具有一定的抗炎作用，進而影響AS的形成，其機制可能是由于大黃總蒽醌能夠有效地減輕肝損傷，從而減少CRP的分泌.

大量研究顯示，動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的發(fā)生與機體脂質(zhì)代謝異常作用密切相關(guān).因此，設(shè)法調(diào)節(jié)機體脂質(zhì)代謝水平是預(yù)防動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的積極途徑之一[24].本實驗采用高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠構(gòu)建高脂大鼠模型，高脂飼料飼養(yǎng)的大鼠的體質(zhì)量均明顯高于普通飼料組，各組大鼠經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn)，高脂飼料組大鼠動脈出現(xiàn)平滑肌細胞增生，并向內(nèi)膜下遷移，內(nèi)膜水腫，明顯的泡沫狀脂質(zhì)顆粒沉積，說明高脂大鼠具有典型的AS癥狀，而大黃總蒽醌對AS有一定抑制作用，其中高劑量大黃總蒽醌作用下胸主動脈修復(fù)效果較好，胸主動脈中泡沫細胞以及血管壁上的病變明顯減少，與陽性對照組動脈壁形態(tài)接近正常對照組，這一結(jié)果提示大黃總蒽醌對高脂大鼠主動脈的影響隨著劑量的增加效果逐步明顯，至高劑量與辛伐他汀用相似，這與前人研究中大黃活性成分的作用效果有劑量依賴關(guān)系較為一致[25]，造成這一結(jié)果可能與大黃總蒽醌具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)以及保肝作用密切相關(guān)，然而關(guān)于唐古特大黃總蒽醌是如何調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路來抑制AS的形成還需進一步研究.