周振歆，易力，常亞軍，楊家方，汪啟兵，馬忠飛，董少忠

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650031

凍干甲型肝炎減毒活疫苗用于預(yù)防由甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）引起的甲型肝炎，自2005年上市以來，該疫苗的安全性和免疫原性良好［1-4］。然而，凍干甲型肝炎減毒活疫苗屬于非最終滅菌的無菌產(chǎn)品［5-6］，根據(jù)《中國藥典》三部（2015 版）滅菌方法規(guī)定：若物品不適合采用最終滅菌法，可選用過濾除菌法或無菌生產(chǎn)工藝達(dá)到無菌保證要求［7］。

2020 年5 月8 日，國家藥品監(jiān)督管理局向中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所下發(fā)了凍干甲型肝炎減毒活疫苗藥品補(bǔ)充申請批件，批準(zhǔn)在該疫苗半成品配制前增加除菌過濾工藝。

本研究對2020 年已完成生產(chǎn)的32 批未經(jīng)除菌過濾和18 批經(jīng)除菌過濾的凍干甲型肝炎減毒活疫苗，按照企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)的要求進(jìn)行全項(xiàng)檢測，并對產(chǎn)品的有效物質(zhì)及殘留物質(zhì)進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，進(jìn)一步研究獲批的除菌過濾工藝對凍干甲型肝炎減毒活疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 供試品及細(xì)胞 取中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所2020 年已完成生產(chǎn)的32 批（批號為1 ~32）未經(jīng)除菌過濾工藝生產(chǎn)的凍干甲型肝炎減毒活疫苗和18 批（批號為33 ~ 50）經(jīng)除菌過濾工藝生產(chǎn)的凍干甲型肝炎減毒活疫苗作為供試品，每批凍干甲型肝炎減毒活疫苗包括2 個(gè)亞批，亞批號用批號-1 和批號-2 表示；KMB17 細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供。

1.2 檢測方法

按照企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)的要求對32 批（包括64 亞批）未經(jīng)除菌過濾工藝和18 批（包括36 亞批）經(jīng)除菌過濾工藝生產(chǎn)的凍干甲型肝炎減毒活疫苗進(jìn)行全項(xiàng)檢測。然后對產(chǎn)品的有效物質(zhì)（病毒感染性滴度、熱穩(wěn)定性）及殘留物質(zhì)（牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量、三氯甲烷殘留量）進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。

1.2.1 鑒別試驗(yàn) 將每批次產(chǎn)品的2 個(gè)亞批合并后使用 ELISA 法進(jìn)行檢測［8-9］，應(yīng)含有 HAV 抗原。

1.2.2 外觀 肉眼觀察每亞批產(chǎn)品均應(yīng)為乳白色疏松體，復(fù)溶后應(yīng)為澄明液體，無異物。

1.2.3 水分、pH 值、滲透壓摩爾濃度、三氯甲烷殘留量、牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量、無菌檢查、異常毒性檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素 按照《中國藥典》三部（2015 版）通則的相關(guān)要求進(jìn)行檢測［7］。其中，每個(gè)亞批均進(jìn)行水分、pH 值、滲透壓摩爾濃度、三氯甲烷殘留量檢測、無菌檢查、異常毒性檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測；每批次的2 個(gè)亞批合并后進(jìn)行牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量檢測。

1.3 病毒感染性滴度檢測 取每個(gè)亞批3 ~ 5 瓶疫苗供試品混合，10 倍系列稀釋至不低于10-8，取不少于3 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度病毒液分別接種KMB17細(xì)胞，置（35.0 ± 0.5）℃培養(yǎng) 24 ~ 26 d，收獲HAV。ELISA 法檢測 HAV 抗原［8-9］；Reed-Muench 法計(jì)算病毒感染性滴度，應(yīng)為 6.67 ~ 7.67 lgCCID50／ mL。

1.4 熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 取每個(gè)亞批3 ~ 5 瓶疫苗于（35.0 ± 0.5）℃放置 72 h 后，按 1.3 項(xiàng)方法進(jìn)行病毒感染性滴度檢測，應(yīng)不低于6.5 lgCCID50／ mL，下降不高于 0.5 lgCCID50／ mL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 20.0 軟件對32 批（包括64 亞批）未經(jīng)除菌過濾工藝和18 批（包括36 亞批）經(jīng)除菌過濾工藝生產(chǎn)的凍干甲型肝炎減毒活疫苗有效物質(zhì)（病毒感染性滴度、熱穩(wěn)定性）及殘留物質(zhì)（牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量、三氯甲烷殘留量）進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

檢測結(jié)果顯示，2020 年32 批（包括64 亞批）未經(jīng)除菌過濾工藝和18 批（包括36 亞批）經(jīng)除菌過濾工藝生產(chǎn)的凍干甲型肝炎減毒活疫苗的鑒別試驗(yàn)、外觀、水分、pH 值、滲透壓摩爾濃度、三氯甲烷殘留量、牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量、無菌檢查、異常毒性檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素、病毒感染性滴度、熱穩(wěn)定性檢測結(jié)果均符合企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)的要求。各批次病毒感染性滴度、熱穩(wěn)定性、水分、牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量、三氯甲烷殘留量、pH 值、滲透壓摩爾濃度趨勢圖見圖1。

圖1 各批次產(chǎn)品病毒感染性滴度（A）、熱穩(wěn)定性（B）、水分（C）、牛血清白蛋白殘留量（D）、抗生素殘留量（E）、三氯甲烷殘留量（F）、pH 值（G）、滲透壓摩爾濃度（H）檢測項(xiàng)目趨勢圖Fig.1 Trend chart of viral infectious titer（A），thermal stability（B），moisture（C），residual bovine serum albumin content（D），residual antibiotics content（E），residual chloroform content（F），pH value（G）and osmol concentration（H）of products of various batches

續(xù)圖1 各批次產(chǎn)品病毒感染性滴度（A）、熱穩(wěn)定性（B）、水分（C）、牛血清白蛋白殘留量（D）、抗生素殘留量（E）、三氯甲烷殘留量（F）、pH 值（G）、滲透壓摩爾濃度（H）檢測項(xiàng)目趨勢圖Fig.1（Continued）Trend chart of viral infectious titer（A），thermal stability（B），moisture（C），residual bovine serum albumin content（D），residual antibiotics content（E），residual chloroform content（F），pH value（G）and osmol concentration（H）of products of various batches

正態(tài)檢驗(yàn)計(jì)算結(jié)果顯示，病毒感染性滴度最大值為 7.23 lgCCID50／mL，最小值為 7.00 lgCCID50／mL，均值為 7.09 lgCCID50／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為 0.089 lgCCID50／mL，服從正態(tài)分布；熱穩(wěn)定性試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，病毒感染性滴度最大值為7.00 lgCCID50／ mL，最小值為6.67 lgCCID50／mL，均值為 6.77 lgCCID50／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為0.085 lgCCID50／mL，服從正態(tài)分布；熱穩(wěn)定性試驗(yàn)后病毒感染性滴度下降值最大值為0.50 lgCCID50／mL，最小值為 0.17 lgCCID50／mL，均值為0.32 lgCCID50／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為0.058 lgCCID50／ mL；牛血清白蛋白殘留量最大值為 11.5 ng ／ mL，最小值為 2.5 ng ／ mL，均值為 5.6 ng ／ mL，標(biāo)準(zhǔn)差為 2.288 ng ／ mL，服從正態(tài)分布；抗生素殘留量最大值為38.2 ng ／ mL，最小值為7.6 ng／mL，均值為 26.1 ng／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為7.557 ng／mL，服從正態(tài)分布；三氯甲烷殘留量最大值為4.08 μg／mL，最小值為 0.00 μg ／ mL，均值為 1.16 μg ／ mL，標(biāo)準(zhǔn)差為 1.378 μg ／mL，服從正態(tài)分布。

獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，除菌過濾前后病毒感染性滴度（t = 0.176，P ＞ 0.05）、熱穩(wěn)定性［包括病毒感染性滴度（t = 1.328，P ＞ 0.05）和病毒感染性滴度下降值（t = -1.913，P ＞ 0.05）］、牛血清白蛋白殘留量（t = -1.850，P ＞ 0.05）、抗生素殘留量（t =-1.525，P ＞ 0.05）、三氯甲烷殘留量（t = -0.043，P ＞0.05）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 除菌過濾前后凍干甲型肝炎減毒活疫苗有效性物質(zhì)和殘留性物質(zhì)檢測結(jié)果Tab.1 Control test results of active substances and residual substances of freeze-dried live attenuated HA vaccine before and after aseptic filtration

3 討 論

《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（2010 版）附錄1 無菌藥品第三條指出：產(chǎn)品的無菌或其他質(zhì)量特性絕不能只依賴于任何形式的最終處理或成品檢驗(yàn)（包括無菌檢查）［5］。2018 年以后，隨著《除菌過濾技術(shù)及應(yīng)用指南》的頒布［10］，進(jìn)一步指出了除菌過濾工藝在非最終滅菌無菌產(chǎn)品中的應(yīng)用。因此，為進(jìn)一步提升凍干甲型肝炎減毒活疫苗的無菌保證水平，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所在原有無菌生產(chǎn)操作工藝的基礎(chǔ)上增加除菌過濾工藝，最大限度地降低了微生物污染的可能性。

除菌過濾工藝是通過除菌過濾器除去流體中的微生物而獲得無菌濾液的生產(chǎn)工藝，除菌過濾的過程不得對產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生不良影響［11-12］。因此，增加除菌過濾工藝應(yīng)主要考慮3 個(gè)方面的內(nèi)容：①除菌過濾對產(chǎn)品有效物質(zhì)的影響。凍干甲型肝炎減毒活疫苗的有效成分HAV 為小RNA 病毒科嗜肝病毒屬（直徑 27~32 nm）［13-14］，除菌過濾器孔徑為 0.22 μm，雖遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于HAV 的孔徑，但0.22 μm 孔徑的定義來源于過濾器微生物截留能力的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，而不是簡單的平均粒徑的表示［15］。因此，除菌過濾過程中應(yīng)重點(diǎn)考察過濾器對病毒含量的影響，包括病毒的吸附［10］、截留等。②除菌過濾對殘留物質(zhì)去除效果的影響。③除菌過濾器材質(zhì)與待過濾介質(zhì)的相容性。過濾器不得因與產(chǎn)品發(fā)生反應(yīng)、釋放物質(zhì)或吸附作用而對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生不利影響［10］。

為此，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所開展了相關(guān)的工藝研究。首先，對凍干甲型肝炎減毒活疫苗半成品配制前增加除菌過濾操作進(jìn)行了小規(guī)模試驗(yàn)，選取3 批凍干甲型肝炎減毒活疫苗原液，每批原液平均分成3 份，分別使用3 家企業(yè)生產(chǎn)的0.22 μm除菌過濾器（濾芯材質(zhì)：PES；有效過濾面積：500 cm2）進(jìn)行除菌過濾操作（共9 次試驗(yàn)），并在除菌過濾前后取樣進(jìn)行病毒感染性滴度檢測，以確定除菌過濾操作對產(chǎn)品有效物質(zhì)損失的影響以及不同企業(yè)生產(chǎn)的除菌過濾器之間的差異性。小規(guī)模試驗(yàn)結(jié)果顯示，除菌過濾前后，產(chǎn)品的病毒感染性滴度無顯著差異，且3 家企業(yè)生產(chǎn)的除菌過濾器間也無顯著差異。然后，根據(jù)小規(guī)模試驗(yàn)結(jié)果及除菌過濾器供應(yīng)情況，選擇其中一家企業(yè)生產(chǎn)的0.22 μm 除菌過濾器進(jìn)行商業(yè)化規(guī)模的3 批工藝驗(yàn)證，并將3 批工藝驗(yàn)證過程中的原液、半成品和成品與3 批2019 年生產(chǎn)的上市批次原液、半成品和成品的檢測結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，除菌過濾操作對凍干甲型肝炎減毒活疫苗的質(zhì)量無影響。除菌過濾器材質(zhì)與待過濾介質(zhì)的相容性方面，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所根據(jù)《除菌過濾技術(shù)及應(yīng)用指南》的要求［10］，對3 家企業(yè)生產(chǎn)的0.22 μm 除菌過濾器分別進(jìn)行了細(xì)菌截留試驗(yàn)（細(xì)菌生存性試驗(yàn)、細(xì)菌挑戰(zhàn)試驗(yàn)）、化學(xué)兼容性試驗(yàn)、可提取物和浸出物試驗(yàn)、產(chǎn)品潤濕完整性檢測試驗(yàn)、吸附性試驗(yàn)及安全性評估驗(yàn)證，結(jié)果證明，所使用的除菌過濾工藝和除菌過濾器安全有效。2019 年8 月，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所將該研究結(jié)果向國家藥品監(jiān)督管理局提請了藥品注冊補(bǔ)充申請，并于2020 年5 月8 日獲得批準(zhǔn)。

工藝變更批準(zhǔn)后，在實(shí)際生產(chǎn)過程中進(jìn)一步確認(rèn)除菌過濾對疫苗質(zhì)量的影響具有重要意義，不僅可進(jìn)一步驗(yàn)證前期工藝變更的可靠性和穩(wěn)定性，又可為今后的疫苗生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持和指導(dǎo)意義，同時(shí)，還可為其他非最終滅菌的無菌產(chǎn)品在提升無菌保障性工藝變更中增加除菌過濾工藝提供相應(yīng)的參考依據(jù)。

因此，本文選取2020 年增加除菌過濾工藝前生產(chǎn)的32 批凍干甲型肝炎減毒活疫苗和增加除菌過濾工藝后生產(chǎn)的18 批凍干甲型肝炎減毒活疫苗進(jìn)行質(zhì)量研究。首先，按照企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)的要求對所有批次產(chǎn)品進(jìn)行全項(xiàng)檢測，分析除菌過濾工藝對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，結(jié)果顯示，所有批次產(chǎn)品的質(zhì)量均符合企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)的要求，除菌過濾前后產(chǎn)品穩(wěn)定性良好。

病毒感染性滴度是評價(jià)HAV 疫苗質(zhì)量和有效期的關(guān)鍵指標(biāo)［16］，因此，通過對增加除菌過濾工藝前后產(chǎn)品的病毒感染性滴度、熱穩(wěn)定性的檢測結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，以研究除菌過濾工藝對疫苗有效物質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，除菌過濾前后產(chǎn)品的病毒感染性滴度、熱穩(wěn)定性檢測結(jié)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均 ＞0.05），表明增加除菌過濾工藝對凍干甲型肝炎減毒活疫苗有效物質(zhì)含量無影響。

另外，本研究進(jìn)一步探討了增加除菌過濾工藝對殘留物質(zhì)去除效果的影響，分別對增加除菌過濾工藝前后的牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量和三氯甲烷殘留量進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，增加除菌過濾工藝前后產(chǎn)品的牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量和三氯甲烷殘留量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。牛血清白蛋白屬于大分子物質(zhì)，凍干甲型肝炎減毒活疫苗生產(chǎn)過程中，主要通過病毒抽提的過程去除雜蛋白，獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，增加除菌過濾工藝前后的牛血清白蛋白殘留量無顯著差異，也進(jìn)一步證明了凍干甲型肝炎減毒活疫苗抽提工藝的有效性和穩(wěn)定性。而病毒抽提過程中，離心后僅吸取上層水相，抽提過程在去除雜蛋白的同時(shí)，也有效去除了有機(jī)溶劑三氯甲烷，因此，經(jīng)獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)顯示增加除菌過濾工藝前后三氯甲烷殘留量無顯著差異的結(jié)果符合產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)。抗生素主要使用在細(xì)胞傳代、培養(yǎng)過程中，獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)結(jié)果也證明了通過清洗細(xì)胞表面和病毒抽提的過程能有效去除抗生素殘留量。

綜上所述，除菌過濾工藝能有效提高產(chǎn)品的無菌保障性，且獲批的除菌過濾工藝對凍干甲型肝炎減毒活疫苗產(chǎn)品質(zhì)量無影響。在今后的生產(chǎn)和檢驗(yàn)過程中，我們還將繼續(xù)關(guān)注增加除菌過濾工藝后凍干甲型肝炎減毒活疫苗的質(zhì)量以及穩(wěn)定性考察結(jié)果［17］，確保生產(chǎn)出安全、有效、符合既定用途的疫苗產(chǎn)品。