任小寧 房昆 鄭皆煒

資料與方法

1 一般資料

1.1 標本來源：患者男，漢族，45歲，無輸血史，2020年9月26日因休克就診于我院急診外科，血紅蛋白（Hb）114 g/L、血細胞比容（Hct）34.2%，申請備血。采集外周靜脈血各2 mL，EDTA抗凝待檢。

1.2 試劑與儀器：單克隆抗-A、抗-B標準血清、抗-A1、抗-H抗體試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限公司，批號分別是20191018、20200522、20191121）、抗-AB抗體試劑（法國Diagast公司，批號837000），ABO標準紅細胞（上海血液生物醫(yī)藥有限公司，批號20205324），篩選細胞（上海血液生物醫(yī)藥有限公司，批號20207030），DG Gel ABOCDE卡（西班牙戴安娜公司，批號19025.01），奧森多雙人份血型卡（ORTHO公司，批號07880），基因組DNA提取試劑盒、第6和第7外顯子 ( Exon6和Exon7）直接測序引物（PAGE級）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成 ，克隆測序試劑，LA-Taq酶及載體（pMD18-T vector）（日本TaKaRa公司產(chǎn)品），所有試劑均在有效期內(nèi)使用。凝膠微柱卡孵育器（西班牙DIANA公司）、全自動血型分析儀（ORTHO公司）貝索離心機和ABI3100基因測序儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）等。

2 方法

2.1 紅細胞ABH抗原檢測：采用強生全自動血型分析儀及IgG抗人球單人份血型卡，檢測患者ABO抗原，后采用試管法復(fù)核：患者全血標本離心備用，取壓積紅細胞洗滌三次，室溫條件下使被檢者紅細胞分別與抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB和抗-H單抗反應(yīng), 鑒定其 ABH 抗原。

2.2 血漿ABO血型抗體及不規(guī)則抗體檢測：采用試管法，使血漿與標準A、B、O型紅細胞反應(yīng)，檢測ABO血型抗體；采用微柱凝膠抗球蛋白試驗，使血漿與抗篩細胞反應(yīng)，檢測不規(guī)則抗體。

2.3 DNA提?。喊础禗NA 提取試劑盒說明書》提取DNA，DNA定量分析后調(diào)整濃度為（20～30）ng/μL，A260/A280比率在1.6～1.9，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 ABO基因Exon6、7直接測序

擴增引物分別為：

PCR擴增反應(yīng)體系：dNTP 400 μmol/L，模板DNA 500 ng，引物0.1 μmol/L，Mg2+2.5 μmol/L，Taq酶3 U，終反應(yīng)體系為50 μL。

PCR擴增反應(yīng)程序如下: 95℃預(yù)變性 10 min；94℃ 60 s，63℃ 90 s，72℃ 60 s，共10個循環(huán)；94℃ 60 s，61℃90 s，72℃ 60 s，25個循環(huán)；72℃延伸10 min，10℃保溫。擴增產(chǎn)物切膠純化后，進行正反雙向測序，測序引物同擴增引物，并在ABI3100-Avant上進行序列分析。（本部分試驗在上海市血液中心輸血研究所完成) 。

2.5 ABO基因克隆測序：采用LA-Taq酶對ABO基因Exon 6、7進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體連接，挑取多個陽性菌落進行序列測定，確定樣本的單倍型。

2.6 序列對比和分析：序列分析使用Chromas和Gentle軟件進行分析，參照人類紅細胞血型基因數(shù)據(jù)庫基因序列進行比對。

結(jié) 果

1 血型血清學(xué)結(jié)果 患者抗篩陰性，存在A抗原減弱；而患者紅細胞與抗-H凝集反應(yīng)（4+）明顯強于正常B型細胞（3+），與抗-A和抗-AB反應(yīng)鏡下觀察存在弱的混合凝集（凝集紅細胞＜10%），血清學(xué)表現(xiàn)推測為Aend亞型，需通過基因檢測進一步判斷。（患者血清學(xué)結(jié)果見表1）。

表1 患者血型血清學(xué)結(jié)果

2 ABO基因Exon6、7直接測序結(jié)果 ABO基因Exon6、7直接測序結(jié)果，外顯子6存在c.261delG，c.297A＞G堿基突變；外顯子7存在c.467C＞T 、c.646T＞A 、c.681G＞A、c.745C＞T、c.771C＞T和c.829G＞A突變，其中c.467C＞T、c.745C＞T突變?yōu)锳3.07等位基因特征，c.261delG推斷可能為O.01.02等位基因。（見圖1）。

圖1 患者基因測序圖

3 ABO基因Exon6、7克隆測序結(jié)果 通過PCR產(chǎn)物的克隆測序，序列經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)存在兩種單倍型，一種為O.01.02，另外1條單倍型序列與A101標準序列對比，發(fā)現(xiàn)c.467C＞T和c.745C＞T突變。經(jīng)檢索基因突變數(shù)據(jù)庫，可以判斷其含有A3.07和O.01.02等位基因。

討 論

ABO亞型是指紅細胞或分泌液（分泌到個體）所含A或B抗原量不同的表型[3]。ABO亞型在中國人群里的檢出率為0.015%[4]。它們大部分是經(jīng)血型血清學(xué)試驗以抗原性弱為主要特征的多種表型，目前由國際輸血協(xié)會確認的A亞型基因型主要有A2、A3、Ax、Am、Ael、Aw，另外血清學(xué)的表現(xiàn)型還有Aint、Aend、Ay等表型[5]。在進行ABO血型鑒定時如果只做正定型,特別容易將亞型誤定為O型[6]。

ABO*A3.07等位基因?qū)е碌腁亞型最早由中國臺灣LEI LI等人[7]報道，國內(nèi)其他地區(qū)有相關(guān)報道[5，8-10]總結(jié)分析ABO*A3.07等位基因?qū)е碌腁亞型可以表現(xiàn)出A3、Ax、Aend亞型的血清學(xué)特征，其中A3表型報道較多[5]。另據(jù)報道A3、B3亞型在中國人群ABO血型系統(tǒng)變異型中較為常見[11]。三者血清學(xué)特征中Ax血清中通常含有弱的抗-A1,紅細胞與抗A弱凝集，與抗AB凝集則較強；A3、Aend亞型最大特征是顯微鏡下呈現(xiàn)混合視野，區(qū)別在于前者有2+混合凝集較強，該患者多次離心后與抗-A和抗-AB反應(yīng)鏡下觀察仍為弱的混合凝集（凝集紅細胞＜10%），推測其為Aend亞型。 出現(xiàn)這種結(jié)果原因可能與本實驗室采用的單克隆抗A的抗體效價不同或針對的細胞抗原表位不同有關(guān)，也有可能是由于A307血型個體差異的不同致紅細胞所表達A抗原量不同有關(guān)；并且由于缺乏人源試劑因此無法明確該患者血型具體的分型，只能推測其為Aend亞型。

對ABO亞型的準確鑒定，需根據(jù)紅細胞與抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H的凝集強度、血漿中是否存在抗-A1以及分泌型人的唾液中的A、B、H物質(zhì)進行區(qū)分[12]?；颊咭虿∏槲床杉僖?，由于無法精準分型，需借助分子生物學(xué)的方法。通過對患者ABO基因的Exon6 、7進行直接基因測序和克隆測序分析，結(jié)果相互驗證，可以判斷其含有A3.07和O.01.02兩個等位基因，分子生物學(xué)的應(yīng)用解決了血清學(xué)的局限性。

另外，亞型必須具有遺傳基礎(chǔ)，并且有明確的血清學(xué)特點。因年齡、疾病、妊娠等不可遺傳的因素造成的血型改變不能認為是亞型；而對于雖有基因改變,卻不影響血清學(xué)特點的ABO血型也不能稱為亞型[13]。該患者因非本地戶籍未做家系研究，但有文獻報道A3.07基因在和先證者父親、先證者以及先證者外甥女三代人中均有檢測到，說明該突變基因能夠穩(wěn)定遺傳[14]。ABO血型抗原基因并不直接編碼ABH抗原，而是編碼產(chǎn)生特異性糖基轉(zhuǎn)移酶，并由它們分別將糖分子轉(zhuǎn)移至抗原表位的糖鏈上而合成 ABO 抗原。ABO糖基轉(zhuǎn)移酶分子鏈中一些氨基酸的不同，決定了其催化產(chǎn)生的糖分子抗原具有不同的特性和亞型。ABO亞型的形成機制常是在ABO基因的7個外顯子及部分內(nèi)含子區(qū)域存在點突變、堿基缺失、替代、插入等造成核苷酸序列的改變[15-16]。ABO*A3.07等位基因中c.745C＞T突變致使第249位氨基酸精氨酸置換為色氨酸（p.Arg259Trp），可能是導(dǎo)致A型糖基轉(zhuǎn)移酶活性降低的主要原因[17]。

ABO血型系統(tǒng)是與臨床安全輸血關(guān)系最為密切的血型，血型鑒定時一定要同時做正、反定型, 可避免亞型的漏檢或誤判。另外，由于試劑抗體的克隆株不同、實驗人員的操作及主觀性，在亞型判別上存在差異，同時亞型的基因遺傳背景復(fù)雜，分子也可能存在異質(zhì)性[16]?？傊环N基因型可對應(yīng)多種表型[18]。因此，對于懷疑是ABO亞型的患者基因檢測是獲得亞型的最直接證據(jù)，但基因分型預(yù)測的血型表型最終還需應(yīng)用血清學(xué)方法進行驗證，并對有意愿患者開展家系調(diào)查，提供輸血安全保障。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突