張 敬，王 燕，侯雅楠，羅夢醒，杜立建

(1. 河北中醫(yī)學院研究生院，河北 石家莊 050090；2. 河北中醫(yī)學院護理學院，河北 石家莊 050200；3. 河北北方學院，河北 張家口 075000；4. 石家莊市中醫(yī)院,河北 石家莊 050051)

膿毒癥是由感染導致的全身炎癥反應綜合征，如果干預不及時，會導致器官功能障礙。急性腎損傷在膿毒癥早期較為常見，發(fā)生率為55%～73%[1-2]，大約70%的感染性急性腎損傷是致命性的[3]。因此，保護腎臟是改善膿毒癥預后的關鍵。益腎化濕顆粒是治療慢性腎小球腎炎的中成藥制劑，沈文清等[4]研究發(fā)現該藥可改善慢性腎臟病患者微炎癥和氧化應激狀態(tài)。劉秀艷[5]報道益腎化濕顆?？梢酝ㄟ^降低白細胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平改善尿毒癥患者微炎癥狀態(tài)，保護殘存腎功能。本研究通過建立膿毒癥急性腎損傷大鼠模型，觀察腎功能、炎癥因子及自噬凋亡相關蛋白表達情況，探討了益腎化濕顆粒對膿毒癥引起急性腎損傷的保護作用及可能作用機制，旨在為臨床中膿毒癥急性腎損傷的治療提供理論參考。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性 SD大鼠32只，體重 (240±10)g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心,動物合格證編號：SCXK(冀)2018-004。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(23±2)℃，12 h的光照/黑暗循環(huán)，自由飲食、飲水，適應環(huán)境1周后進行實驗。實驗程序和實驗方案均按照動物實驗倫理原則執(zhí)行，并經河北醫(yī)科大學動物實驗委員會批準。

1.2實驗藥物及試劑 益腎化濕顆粒(廣州康臣藥業(yè)有限公司生產，規(guī)格：10 g×9袋)。根據藥理試驗中動物與人體間的等效劑量換算方法，計算出益腎化濕顆粒高劑量為150 mg/(kg·d)、低劑量為100 mg/(kg·d)。白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、TNF-α qPCR試劑盒(美國promega公司) ，總RNA提取試劑盒(Biotek, Winooski, VT, USA)，BCA蛋白濃度檢測試劑盒(北京索萊寶公司)；LC3抗體、p-Akt抗體、Beclin-1 抗體、Caspase-3 抗體、Akt 抗體及GAPDH 抗體(Cell Signaling Technology公司)；脂多糖(LPS，Sigma-Aldrich公司)；PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I(美國 BD 公司)；其他所用生化試劑均為國產分析純。

1.3實驗方法 將32只大鼠隨機分為對照組、模型組、益腎化濕顆粒低劑量組、益腎化濕顆粒高劑量組，每組8只。除對照組大鼠腹腔注射生理鹽水外，其余組大鼠均腹腔注射LPS(溶解于生理鹽水)10 mg/kg建立膿毒癥急性腎損傷模型，以血肌酐(SCr) 水平增加到對照組的2倍時為建模成功。建模成功后，益腎化濕顆粒低、高劑量組分別給予益腎化濕顆粒100 mg/(kg·d)和150 mg/(kg·d)灌胃，對照組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃，均每天1次，連續(xù)3 d，實驗過程中各組大鼠自由飲水與進食。

1.4觀察指標及方法

1.4.1血尿素氮(BUN)及SCr水平 灌胃結束后，各組大鼠背側尾靜脈取血， 采用全自動生化分析儀(TC6010 L, 江西泰康科技股份有限公司)，以苦味酸法測定SCr水平，以尿素酶法測定BUN水平。

1.4.2腎組織形態(tài)學觀察 各組大鼠經戊巴比妥鈉注射液(50 mg/kg)腹腔注射安樂死，取腎臟組織，采用4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)方法脫水，然后浸蠟、包埋、切片，HE染色，在光學顯微鏡下觀察腎臟組織的病理學形態(tài)，每張切片隨機選取5個視野拍照記錄。

1.4.3腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達檢測 取各組大鼠腎臟組織50～60 mg，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，使用ScanDrop 100 (AnalytikJena, Thuringia, Germany)測定器測定mRNA濃度。取OD260/OD280比值在1.8～2.0間的mRNA樣品，反轉錄成 cDNA，將 cDNA 放于熒光定量 PCR 儀擴增。采用 Primer 5． 0 軟件設計引物，引物序列:IL-1β上游為5’-AAATACCTGTGGCCTTGGGC-3’，下游為5’-CTTGGGATCCACACTCTCCAG-3’，引物長度101 bp；IL-6上游為5’-GAGTCCTTCAGAGAGATACAG-3’，下游為5’-CTGTGACTCCAGCTTATCTG-3’，引物長度125 bp；TNF-α上游為 5 ’-GTCTCAGCCTCTTCTCATTC-3’，下 游為5 ’-CATAGAACTGAT GAGAGGGA-3’，引物長度128 bp。反轉錄成功后，使用qPCR試劑盒，采用SYBR?Green I方法進行RT-PCR檢測。以β-actin作為參照基因，用對照組進行校準，參照Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct(ΔΔCt)方法計算目的基因的相對表達量(2-ΔΔCt)。

1.4.4腎組織中LC3、Beclin-1、Caspase-3及p-Akt蛋白表達檢測 采用Western blot方法檢測：取各組大鼠腎臟組織50～60mg，放入勻漿器里在冰上勻漿，加入蛋白裂解液，冰上放置 60 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液,用BCA蛋白濃度檢測試劑盒定量檢測。取30 μg蛋白樣品，用10%SDS-PAGE電泳分離，90 V轉移1～2 h至PVDF膜，然后放進封閉液里37 ℃條件下靜置2 h，加入TTBS稀釋的一抗(LC3 1∶1 000，Beclin-1 1∶1 000， Caspase-3 1∶500，p-Akt 1∶1 000，Akt 1∶1 000，GAPDH 1∶1 500)，4 ℃冰箱中過夜。TTBS洗膜5 min×3，加入用1 mL TTBS稀釋的過氧化物酶所標記過的二抗，37 ℃ 1.5 h，TTBS洗膜10 min×3，TBS洗膜5 min×1。用Odyssey成像系統進行顯色并分析所得數據。

1.5統計學方法 所有數據應用SPSS Statistics 17.0統計軟件進行統計分析，計量資料呈正態(tài)分布，多組間比較采用方差分析，兩個均數比較采用SNKq檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠血清BUN、SCr水平比較 實驗過程中，模型組有2只、益腎化濕顆粒低劑量組有1只大鼠死亡。模型組、益腎化濕顆粒低劑量組、益腎化濕顆粒高劑量組大鼠血清BUN、SCr水平均明顯高于對照組(P均<0.05)，益腎化濕顆粒低、高劑量組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且益腎化濕顆粒高劑量組均明顯低于益腎化濕顆粒低劑量組(P均<0.05)。見圖1及圖2。

圖1 對照組和膿毒癥急性腎損傷各組大鼠血清BUN水平

圖2 對照組和膿毒癥急性腎損傷各組大鼠血清SCr水平

2.2各組大鼠腎組織病理形態(tài) 對照組大鼠腎臟組織結構完整且清晰，間質中未發(fā)現明顯的炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞胞質染色均勻，細胞核居中，沒有發(fā)現明顯的變性及壞死；模型組大鼠腎小管結構破壞，大量腎小管上皮細胞發(fā)生變性及壞死，間質中有較多的炎性細胞浸潤；益腎化濕顆粒低、高劑量組大鼠腎臟組織損傷程度較模型組輕。見圖3。

圖3 對照組和膿毒癥急性腎損傷各組大鼠腎組織HE 染色表現(×200)

2.3各組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達情況 模型組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達量均明顯高于對照組(P均<0.05)，益腎化濕顆粒低、高劑量組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且益腎化濕顆粒高劑量組均明顯低于益腎化濕顆粒低劑量組(P均<0.05)。見圖4。

圖4 對照組和膿毒癥急性腎損傷各組大鼠腎組織中促炎細胞因子mRNA表達情況

2.4各組大鼠腎組織中自噬相關蛋白表達情況 模型組大鼠腎組織中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ及Beclin-1、Caspase-3、p-Akt表達量均明顯高于對照組(P均<0.05)，益腎化濕顆粒低、高劑量組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且益腎化濕顆粒高劑量組均明顯低于益腎化濕顆粒低劑量組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 對照組和膿毒癥急性腎損傷各組大鼠腎組織中自噬相關蛋白表達情況

3 討 論

膿毒癥是由于宿主對感染的調節(jié)失常引起的，是急性腎損傷的首要因素，約占重癥監(jiān)護病房急性腎損傷病例的50%左右[6]，膿毒癥幸存者慢性腎臟病發(fā)生率也較高[7]。病理生理學研究表明，炎癥反應參與膿毒性急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展，炎性細胞因子 IL-6 、TNF-α等水平增高可導致死亡風險增加[8]。但由于膿毒癥急性腎損傷的發(fā)生機制復雜，目前該病仍然沒有特效的治療方法。

中醫(yī)學中沒有與“膿毒癥”相關的病名，根據其臨床表現多將其歸屬于“傷寒”“溫病”中，早期對于膿毒癥的證型分析多為熱毒內蘊、瘀血互結，隨著對膿毒癥研究的深入，扶正固本成為治療的關鍵。急性腎損傷雖然在中醫(yī)學中也無記載，但其尿量逐漸減少甚至無尿的臨床表現與中醫(yī)的“關格”“癃閉”“水腫”類似，其病機為本虛標實，脾腎衰敗，氣、血、水濕代謝平衡失調，導致水濕、痰濁、血瘀內蘊而發(fā)本病。益腎化濕顆粒方中人參增補元氣，腎為氣之本，起到固本的功效；黃芪健脾益氣，脾為后天之本，后天充足以滋養(yǎng)先天；白術、茯苓、澤瀉配伍利水滲濕、健脾消腫；陳皮、清半夏合用健脾燥濕化痰；白芍養(yǎng)陰柔肝、緩中止痛；羌活、獨活、防風合用疏風化濕；黃連清熱燥濕、解毒，清除體內瘀積的水濕、毒素；柴胡調暢氣機，升舉陽氣；甘草補脾益氣，調和諸藥。諸藥合用，共同調節(jié)機體上、中、下三焦水液代謝，以達益腎健脾、利水消腫之效。現代藥理研究表明，人參中人參皂苷Rc可以通過抑制TANK結合激酶1(TBK-1) /干擾素調節(jié)因子-3(IRF-3)而減輕炎癥反應[9]；茯苓多糖可以恢復脾虛大鼠的腸道菌群穩(wěn)態(tài)，增強免疫功能[10]；黃芪具有調節(jié)機體免疫、抑制炎癥反應、清除體內毒素作用[11]。前期研究發(fā)現，對于一些慢性腎臟病及膿毒癥患者，運用益腎化濕顆?？上抡{患者血漿TNF-α、降鈣素原(PCT)、C 反應蛋白(CRP)、白細胞介素-10(IL-10)水平[4-5，12-14]。

本實驗采用LPS建立膿毒癥急性腎損傷大鼠模型，結果模型組大鼠血清 Cr、BUN 水平及腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達量均明顯升高，腎小管上皮細胞受損；益腎化濕顆粒低、高劑量組大鼠血清 Cr、BUN 水平及腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達量均明顯降低，腎小管上皮細胞受損程度明顯減輕。提示益腎化濕顆粒可明顯減輕膿毒癥急性腎損傷，可下調炎癥因子表達，抑制炎癥反應。

在膿毒癥發(fā)病期間，不僅存在大量細胞壞死，同時也伴隨著細胞的自噬與凋亡。自噬相關蛋白LC3是自噬體膜的標志蛋白，分為Ⅰ型和Ⅱ型，貫穿自噬體形成的始終，LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ增加提示自噬體形成。已有研究發(fā)現，在膿毒癥小鼠模型中，敲除關鍵性的自噬基因 LC3 和 Beclin-1 后，也會影響炎癥因子IL-1β、IL-18 的表達，提示自噬在膿毒癥發(fā)病及炎癥反應中起著關鍵作用[15-16]。Caspase-3 是細胞凋亡的一個必要效應蛋白酶，其可通過作用于細胞凋亡和炎癥通路，參與細胞凋亡小體的形成過程。磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信號通路參與調控炎癥反應，其主要通過 Akt 的下游蛋白調控炎癥介質的表達，如mTOR、GSK-3β、FOXO1等[16-17]。本實驗結果顯示，模型組大鼠腎組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1、Caspase-3、p-Akt表達量均明顯升高，益腎化濕顆粒低、高劑量組均明顯低于模型組。提示益腎化濕顆?？梢种颇摱景Y急性腎損傷大鼠腎臟細胞的自噬與凋亡。

綜上所述，益腎化濕顆?？梢詼p輕膿毒癥急性腎損傷，保護腎功能，分析與下調炎癥因子和自噬凋亡相關蛋白表達，從而抑制炎癥反應和腎小管上皮細胞自噬凋亡有關，為臨床早期治療膿毒癥急性腎損傷提供了一定理論依據。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。