劉開湘 （廣東省大埔縣大麻中學(xué) 廣東梅州 514299）

靈芝是一種珍貴藥材，被古人譽(yù)為“仙草”，具有補(bǔ)氣益血、養(yǎng)心、安神、利關(guān)節(jié)、止咳平喘等功效。現(xiàn)代認(rèn)為，靈芝孢子粉有抗癌作用，藥效為靈芝的75 倍［1］。人教版選修1 開設(shè)了“微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)”的專題實(shí)驗(yàn)，為了培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)微生物學(xué)知識(shí)的興趣，筆者通過靈芝栽培拓展設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，讓學(xué)生在栽培實(shí)驗(yàn)中學(xué)習(xí)微生物菌種及其來源，培養(yǎng)基制備、接種、培養(yǎng)，以及子實(shí)體形成、防止污染等微生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)。

1 基礎(chǔ)知識(shí)

1.1 培養(yǎng)基配方 靈芝通常生活在腐樹或活樹木的根部，對(duì)木質(zhì)素、纖維素等有很強(qiáng)的吸收、分解能力。采用木屑、棉籽殼、麥麩、米糠或農(nóng)作物秸稈作為原料，再補(bǔ)充適量氮源和水配制培養(yǎng)基。培養(yǎng)基原料組成如下：棉籽殼65%，麥麩20%，黃豆粉10%，石膏1%，石灰1%，磷酸二氫鉀1%，食鹽1%，蔗糖1%化水，總料:水=1∶1.3。不添加殺蟲劑 和抗生 素［2］。

1.2 無菌技術(shù) 對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、培養(yǎng)室、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔、消毒；對(duì)實(shí)驗(yàn)器具、接種工具和培養(yǎng)基（袋裝培養(yǎng)料）進(jìn)行常壓蒸汽高溫消毒；接種等實(shí)驗(yàn)操作在酒精燈火焰附近進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)操作

2.1 制備木質(zhì)素培養(yǎng)基 培養(yǎng)基原料按配方比例稱量，按先多量、后少量順序混合，干翻至原料均勻，蔗糖水拌入料中，濕翻幾次至料粒均勻、濕水，并緊握培養(yǎng)料有水滲出但不下滴（含水量約60%）。選取長33 cm、寬15 cm 且一側(cè)封口的低壓聚乙烯塑料袋，每袋裝入攪拌均勻的培養(yǎng)料1.5 kg 左右，裝料時(shí)要先塞緊4 角，并按外實(shí)內(nèi)松要求裝至16 cm 高，用塑料繩扎緊袋口。

2.2 培養(yǎng)基消毒 裝好料后要及時(shí)消毒，采用常壓蒸汽高溫消毒。為了消毒徹底，保持培養(yǎng)料在100℃的蒸鍋中連續(xù)消毒8～9 h。高溫消毒結(jié)束并冷卻至30℃以下時(shí)即可接種。

2.3 接種 采購靈芝栽培菌種用于接種。接種時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，在接種時(shí)雙手入箱，用75%酒精擦手后，再用酒精擦洗菌種瓶外壁及接種鉤。將接種鉤在火焰上方充分灼燒、冷卻后打開菌種瓶蓋，轉(zhuǎn)動(dòng)瓶口用酒精燈火焰滅菌，迅速挑取菌種接入料袋中，及時(shí)密封袋口。

2.4 發(fā)菌 接種前要對(duì)培養(yǎng)室的培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行消毒和除蟲處理。接種后將菌袋置于培養(yǎng)室，平放在地面上層層堆積。發(fā)菌期間保持室溫和一定的濕度，白天保持有足夠的散射光。經(jīng)過30 d 左右的培育，菌絲發(fā)滿整個(gè)菌袋。

2.5 出芝 菌絲長滿后，用消毒后的刀片在袋口處劃開1 個(gè)出芝口，培養(yǎng)一定時(shí)間后出芝口會(huì)有乳白色的靈芝子實(shí)體原基形成。此時(shí)，保持濕度和通風(fēng)，讓子實(shí)體開片。用噴水進(jìn)一步加大空氣相對(duì)濕度，并加強(qiáng)通風(fēng)透氣，促使靈芝菌蓋快速膨大。

2.6 孢子粉和子實(shí)體采收 組織學(xué)生進(jìn)行采集孢子粉和采收子實(shí)體。在子實(shí)體即將成熟時(shí)，指導(dǎo)學(xué)生將滅菌后的采集袋罩在靈芝菌蓋外，采集袋的袋口扎緊在靈芝菌柄上，在采集袋下部開有一組通氣孔，位于靈芝菌蓋下方。一段時(shí)間后，將采集袋取下，收集采集袋內(nèi)孢子粉，并用排筆毛刷收集靈芝菌蓋上的孢子粉。收集完孢子粉后，采收子實(shí)體，指導(dǎo)學(xué)生一手按住菌袋，一手握住子實(shí)體菌柄慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)，輕輕拔出靈芝。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)是微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的拓展，生物學(xué)興趣小組經(jīng)過3 個(gè)月的實(shí)踐操作，取得了一定成果，收獲子實(shí)體30 個(gè)，采集子實(shí)體生產(chǎn)的孢子粉16.2 g。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、圖1～圖4。

表1 靈芝的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

圖1 袋裝培養(yǎng)料

圖2 出芝

圖3 受污染的培養(yǎng)基

圖4 收集的孢子粉

3.2 討論和分析 實(shí)驗(yàn)操作中，袋裝培養(yǎng)基制作和接種是成功的。但有6 袋培養(yǎng)袋沒有出芝，其中4 袋在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)了被青霉等雜菌感染的情況。師生討論和分析認(rèn)為：學(xué)生在制備培養(yǎng)料和接種過程嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行，設(shè)備和培養(yǎng)室消毒得當(dāng)，制料和接種的滅菌是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹５诎l(fā)菌過程中，培養(yǎng)料袋的翻動(dòng)次數(shù)不夠、發(fā)菌時(shí)濕度過大等因素造成個(gè)別培養(yǎng)基發(fā)菌不理想。此外，在劃口出芝操作中，個(gè)別學(xué)生使用的刀片未經(jīng)嚴(yán)格消毒，導(dǎo)致培養(yǎng)基被青霉等雜菌污染，造成出芝失敗。通過實(shí)驗(yàn)，學(xué)生深刻體會(huì)到微生物培養(yǎng)過程中保持培養(yǎng)物純凈和無菌操作的重要性。

實(shí)驗(yàn)操作中，對(duì)靈芝菌種的來源進(jìn)行了討論：接種的菌種是怎樣獲得的？收集的靈芝孢子粉是否可作為菌種進(jìn)行接種栽培？師生通過討論后分析認(rèn)為：靈芝屬于擔(dān)子菌，孢子是單核的擔(dān)孢子。在自然條件下，孢子長成單核菌絲，通過兩性單核菌絲結(jié)合成雙核菌絲進(jìn)行繁殖。人工栽培中，靈芝孢子或單核菌絲不用于作菌種，母種可通過培養(yǎng)單核菌絲結(jié)合成雙核菌絲或通過子實(shí)體組織進(jìn)行選擇培養(yǎng)而獲得，母種再經(jīng)過多次培養(yǎng)，制成大量的原種和栽培種。本實(shí)驗(yàn)接種的菌種是靈芝栽培種。

4 實(shí)驗(yàn)總結(jié)

本節(jié)實(shí)驗(yàn)操作是教材實(shí)驗(yàn)的拓展，從生產(chǎn)實(shí)例入手，構(gòu)建“與社會(huì)聯(lián)系”的教學(xué)情境，讓學(xué)生體驗(yàn)科學(xué)技術(shù)聯(lián)系社會(huì)［3］。讓原本略顯枯燥的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)變得有趣而充滿收獲的成功感。實(shí)驗(yàn)中充分發(fā)揮了學(xué)生的主動(dòng)性，讓學(xué)生通過親身體驗(yàn)和操作實(shí)踐，學(xué)習(xí)培養(yǎng)基的制備、接種和無菌操作等微生物培養(yǎng)的基本技能，在實(shí)踐中充分掌握“微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)”的核心概念和知識(shí)。此外，通過理論聯(lián)系實(shí)際，學(xué)生拓展學(xué)習(xí)了靈芝栽培的菌種形成和靈芝繁殖的相關(guān)知識(shí)，有效激發(fā)了學(xué)習(xí)微生物學(xué)的興趣。