盧文燕，張 明

(1.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部2018級；2.江西省人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,南昌 330006)

急性心肌梗死(AMI)是在冠狀動脈粥樣硬化病變的基礎(chǔ)上，因冠脈管腔內(nèi)血栓形成，造成急性冠脈閉塞，相應(yīng)心肌細(xì)胞供血中斷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞嚴(yán)重而持久的急性缺血性壞死。為了盡快使閉塞的血管再通，再灌注治療已成為目前治療AMI的重要緊急措施。再灌注治療方法包括溶栓治療和急診經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)，但由于急診PCI在基層醫(yī)院可能并未開展或者技術(shù)不成熟，導(dǎo)致患者轉(zhuǎn)入上級醫(yī)院時已經(jīng)造成部分心肌細(xì)胞缺血壞死，而溶栓治療又有其適應(yīng)證、禁忌證，部分患者不宜進(jìn)行溶栓治療，同樣造成心肌梗死。其中更有部分急性期患者因未能及時疏通或重建血運(yùn)而迅速造成大面積心肌梗死，心臟為維持其泵血功能，發(fā)生退行性左室重塑，甚至形成室壁瘤，最終導(dǎo)致心功能不斷惡化而心力衰竭。以往認(rèn)為成熟的心肌細(xì)胞缺乏再生能力，心肌梗死發(fā)生后，梗死區(qū)心肌只能通過纖維增生，由無收縮功能的疤痕組織代替。因而即使恢復(fù)或重建血運(yùn)通路，也不能從根本上修復(fù)壞死心肌組織。心肌梗死后在梗死灶周邊及正常的心肌組織中也有少量心肌細(xì)胞發(fā)生有絲分裂，以增殖修復(fù)受損的心肌組織。而TAKAHASHI等[1]的研究表明骨髓單個核細(xì)胞(MNCs)培養(yǎng)液能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子通過直接保護(hù)心肌細(xì)胞，增強(qiáng)心肌的收縮能力，抑制心肌細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)梗死灶周圍微血管生成，從而促進(jìn)梗死心臟功能的改善。

干細(xì)胞是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有分化成各種細(xì)胞、組織、器官的潛在功能。根據(jù)來源不同，分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞面臨細(xì)胞標(biāo)本短缺、免疫排斥、倫理道德等方面的問題，使之應(yīng)用受限。骨髓干細(xì)胞(BMCs)屬于成體干細(xì)胞，目前認(rèn)為其主要包含以下兩類干細(xì)胞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和造血干細(xì)胞。由于骨髓干細(xì)胞通過溫和的機(jī)械分離即能制備單細(xì)胞懸液，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，來源廣泛，且可自體移植，受到廣大學(xué)者的青睞。骨髓干細(xì)胞能分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及多種細(xì)胞因子等。因此，通過干細(xì)胞移植阻止心臟衰竭的惡化進(jìn)程甚至去恢復(fù)心肌損傷患者的心功能，給心肌梗死的治療開辟了一個嶄新的前景。本文就干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死的作用機(jī)制、研究狀況、存在的問題及前景進(jìn)行綜述。

1 作用機(jī)制

1.1 干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞

早在1999年TOMITA等[2]研究表明，體外培養(yǎng)中，5-aza培養(yǎng)的BMCs可形成肌鈣蛋白Ⅰ和肌球蛋白重鏈染色陽性的肌小管；體內(nèi)研究中，將BMCs移植到冷損傷性心臟痕組織中，8周后檢測也可見心肌樣肌細(xì)胞，肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白Ⅰ染色陽性，心臟功能較前顯著改善。SZARAZ等[3]利用qPCR技術(shù)分析體外培養(yǎng)基cTnT和MYH6基因表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組cTnT mRNA水平高于對照組，MYH6 mRNA的表達(dá)在干細(xì)胞分化過程中也被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。并采用流式細(xì)胞術(shù)分析心源性分化標(biāo)記物，結(jié)果顯示心肌細(xì)胞標(biāo)記信號調(diào)節(jié)蛋白α和縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達(dá)水平高于對照組，表明間充質(zhì)干細(xì)胞能分化為功能性心肌細(xì)胞樣細(xì)胞。

1.2 干細(xì)胞旁分泌機(jī)制產(chǎn)生多種細(xì)胞因子

TAKAHASHI等[1]在研究中發(fā)現(xiàn)BMCs無論是在缺氧還是常氧條件下均能明顯抑制成齡大鼠心肌細(xì)胞的凋亡，同時增加梗死后心肌微血管的密度，縮小纖維瘢痕的面積，明顯提高心臟的功能。他們收集BMCs的培養(yǎng)液做ELISA和Western bloting分析，發(fā)現(xiàn)BMCs產(chǎn)生了多種細(xì)胞因子(包括VEGF、IL-6、PDGF、IGF-1)，其中一些在缺氧的條件下是明顯增加的。研究表明BMCs產(chǎn)生的細(xì)胞因子增強(qiáng)了心肌細(xì)胞對抗缺血損傷的能力，誘導(dǎo)了血管的新生，抑制了梗死心臟的重構(gòu)，這對干細(xì)胞移植治療心肌梗死意義重大。TANG等[4]對心肌梗死小鼠進(jìn)行自體MSCs移植，2個月后發(fā)現(xiàn)小鼠梗死區(qū)毛細(xì)血管密度增高，VEGF表達(dá)明顯升高，心肌細(xì)胞凋亡減少，心功能明顯改善。其可能機(jī)制為MSCs在損傷區(qū)域可以自身分泌和上調(diào)周邊細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞活性因子；MSCs自我更新能力能維持長期的血管再生狀態(tài)。

1.3 干細(xì)胞減少炎癥因子

LUGER等[5]將小鼠左前降支阻斷45 min，在心肌梗死后24 h，實(shí)驗(yàn)組靜脈注射2×106MSCs，對照組注射生理鹽水，每組各16只，21 d后，發(fā)現(xiàn)MSCs組明顯降低心臟和脾臟的自然殺傷細(xì)胞和心臟的中性粒細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死前24 h特異性自然殺傷細(xì)胞耗竭可改善梗死面積、左心室射血分?jǐn)?shù)、左室重構(gòu)及減少心臟中性粒細(xì)胞。這表明MSCs通過全身抗炎作用改善急性心肌梗死的左心功能障礙。

1.4 干細(xì)胞外泌體發(fā)揮重要作用

干細(xì)胞分泌的胞外小泡有刺激血管生成，保護(hù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。DOUGHERTY等[6]從人類誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞源性心肌細(xì)胞(hiPSC-CM)培養(yǎng)基中分離出分泌顆粒，并用射透電鏡、納米粒子追蹤分析、免疫印跡證實(shí)了分泌顆粒的大小和形態(tài)與外泌體一致。此外，在研究外泌體對牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)的管壁形成、傷口愈合和細(xì)胞增殖的影響時發(fā)現(xiàn)，與對照組(NO-Exosomes)相比，100 μg·mL-1CM-ES處理的BAEC在管壁形成、傷口愈合和細(xì)胞增殖方面均有顯著提高。結(jié)果表明，從hiPSC-CM中分離出的Exosomes能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成和細(xì)胞增殖。該研究闡明了干細(xì)胞移植治療心肌梗死新的作用機(jī)制，為疾病的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。

2 基礎(chǔ)與臨床研究現(xiàn)狀

2.1 基礎(chǔ)研究

LUO等[7]為了解決干細(xì)胞生長、保存和運(yùn)輸?shù)膯栴}，將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子包裝成聚乳酸-乙醇酸微粒子，然后包被MSC膜，形成非物理粒子合成MSC(或synMSC)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，synMSC顯示出與真MSC相似的因子釋放譜和表面抗原，并能發(fā)揮MSC的促進(jìn)心肌細(xì)胞和血管再生的功能及顯示低溫環(huán)境下體外或體內(nèi)保存和凍干穩(wěn)定性。LUGER等[5]對鼠的研究發(fā)現(xiàn)注射生理鹽水對照組左室重構(gòu)不良，左室射血分?jǐn)?shù)惡化，而靜脈給予間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組消除了左室舒張末期容積和左室收縮末期容積的惡化，另外在缺血性心肌病模型中，心肌梗死后4周給予小鼠(n=16)尾靜脈注射2×106MSCs，第3周重復(fù)注射，與對照組(n=16)相比，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組左室射血分?jǐn)?shù)明顯增加，左室收縮末期容積減少。MENG等[8]將白介素10(IL-10)基因通過轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)整合到羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(AMM)基因組中，并翻譯成IL-10基因編輯的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(AMM/I)，將AMM/I移植到AMI小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)AMM/I移植可明顯抑制CD68陽性或F4/80陽性的浸潤性炎癥細(xì)胞，降低梗死心肌中促炎因子的表達(dá)。此外，還發(fā)現(xiàn)，采用AMM/I移植的小鼠心肌細(xì)胞周圍毛細(xì)血管密度明顯增加，梗死面積明顯縮小，左室功能得到改善，并且AMM/I對心肌細(xì)胞凋亡具有高度抑制作用。此項(xiàng)研究表明，AMM/I移植通過抑制細(xì)胞炎癥、增加毛細(xì)血管密度、抑制細(xì)胞凋亡等方面的作用，對左心室功能的早期恢復(fù)和重構(gòu)發(fā)揮了良好的作用。然而移植的細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下存活不良會降低其治療效果。Follistatin-like 1(Fstl1)是一種新型促生存的心肌因子，在缺血環(huán)境中對細(xì)胞具有保護(hù)作用。SHEN等[9]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺氧條件下模擬心肌缺血環(huán)境，分別于缺氧后0、24、48 h檢測Fstl1的表達(dá)，在低氧處理48 h后，進(jìn)一步收集間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞死亡和增殖試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fstl1在缺氧間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)呈明顯的時間依賴性下降，體外研究進(jìn)一步證實(shí)Fstl1促進(jìn)缺氧間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和增殖。因此可以推測，F(xiàn)stl1可以顯著延長MSC植入人體后的存活時間。同時他們將MSCs(MSCs-mcherry)或Fstl1過表達(dá)MSCs(MSCs-fstl1)注入小鼠梗死周圍區(qū)，在治療后1、3、7 d對供體細(xì)胞的保留情況進(jìn)行評估，并計(jì)算梗死面積、梗死心臟的新生血管及心肌功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSCs-fstl1組顯著延長供體細(xì)胞的存活時間，并且通過限制瘢痕形成、減少炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)新生血管，明顯改善心肌梗死后的心功能。這表明fstl1是一種促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活和增殖的內(nèi)源性心臟因子，可以優(yōu)化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的治療效果。

2.2 臨床研究

KIM等[10]進(jìn)行的一項(xiàng)隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)，將26例急性ST段抬高型心肌梗死PCI術(shù)后患者分為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)組(n=14)和對照組(n=12)，對照組在梗死后給予常規(guī)治療，BM-MSC組在PCI術(shù)后1個月冠狀動脈內(nèi)注射自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并給予常規(guī)治療。觀察左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)從基線到隨訪4個月后的變化。通過SPECT測定，BM-MSC組LVEF較對照組明顯增加。通過超聲心動圖測定，隨訪4個月時LVEF增加幅度細(xì)胞組顯著高于對照組[(9.0±4.7)%比(5.3±2.6)%，P=0.023]。在整個研究過程中，細(xì)胞移植并未增加不良臨床事件、支架內(nèi)再狹窄或心律失常風(fēng)險(xiǎn)。LI等[11]進(jìn)行了一項(xiàng)80例患者參與的隨機(jī)對照試驗(yàn)，在成功完成再灌注治療后1個月，經(jīng)冠狀動脈注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞至梗死相關(guān)動脈，隨訪6個月后發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組LVEF的改善幅度明顯大于對照組[(5.9±8.5)%比(1.6±7.0)%，P=0.037]，在治療過程中，未發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療相關(guān)毒性，隨訪期間無明顯不良心血管事件發(fā)生?？梢姡跔顒用}內(nèi)灌注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是安全有效的。張艷平等[12]將8項(xiàng)隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)共410例納入薈萃分析，結(jié)果顯示在有效性方面，移植后3、6、12個月，移植組左室射血分?jǐn)?shù)均較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在安全性方面，移植組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肖文濤等[13]進(jìn)行的一項(xiàng)自體MNCs、MSCs經(jīng)梗死相關(guān)冠狀動脈(IRCA)內(nèi)序貫移植治療AMI的臨床研究，分別于移植后3、6個月測定LVEF和心肌灌注缺損面積百分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示移植組LVEF和心肌灌注缺損面積百分?jǐn)?shù)均較對照組明顯改善，且2組惡性心血管事件發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

然而LAGUNA等[14]選用LVEF低于50%，有冠脈搭橋(CABG)適應(yīng)證的20例透壁性心肌梗死患者進(jìn)行隨機(jī)對照試驗(yàn)，在急性心肌梗死后第10—15天，干細(xì)胞組在體外循環(huán)下采用心肌內(nèi)直接注射骨髓單個核細(xì)胞(MNCs)，對照組僅行CABG治療。術(shù)前、術(shù)后9個月行釓磁共振成像及應(yīng)激性超聲心動圖檢查。最后17例患者完成隨訪，分析研究結(jié)果，在2組基線特征基本一致的前提下，2組LVEF變化幅度、整體室壁運(yùn)動減低水平或局部室壁運(yùn)動減低水平、舒張末期容積下降幅度或收縮末期容積下降幅度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此項(xiàng)研究結(jié)果表明，AMI患者在冠脈搭橋時心肌內(nèi)注射MNCs對心室重構(gòu)及心臟功能無中—遠(yuǎn)期改善作用。另外NICOLAU等[15]的隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)也得出相似結(jié)論，即冠狀動脈內(nèi)灌注MNCs并沒有改善左心室重構(gòu)或減少梗死面積。但從具體數(shù)值上分析，在LAGUNA等[14]的研究細(xì)胞組的指標(biāo)除局部室壁運(yùn)動減低水平外，其余指標(biāo)均優(yōu)于對照組，且該研究樣本量少，用于結(jié)果分析的僅17例，這可能影響試驗(yàn)結(jié)果的說服力。所以需要開展更多大樣本、多中心、雙盲、隨機(jī)對照試驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。綜合分析以上研究，不難發(fā)現(xiàn)各方研究者利用的移植時間、移植途徑、細(xì)胞種類、細(xì)胞數(shù)量、患者初始左室射血分?jǐn)?shù)不一，造成研究結(jié)果不盡相同。在今后通過控制這些可控因素，將干細(xì)胞聯(lián)合某種或多種細(xì)胞因子整合到生物材料中，以期尋找一種最優(yōu)化組合，為臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療心肌梗死提供強(qiáng)有力的治療方案。

3 存在的問題

3.1 干細(xì)胞歸巢率、分化率差

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是心肌細(xì)胞修復(fù)和再生的種子細(xì)胞，但其歸巢率和分化率差，不能最大程度分化成心肌細(xì)胞，在臨床應(yīng)用中受到了一定的限制。YANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)超聲靶向微泡破壞介導(dǎo)的趨化因子 12(CXCL 12)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)共轉(zhuǎn)染能顯著促進(jìn)干細(xì)胞移植后梗死心肌的修復(fù)和再生；LU等[17]的研究也表明間充質(zhì)干細(xì)胞通過CXCL 12趨化途徑向梗死灶周邊招募常駐心臟內(nèi)皮細(xì)胞，從而改善AMI小鼠模型的心臟功能，其中CXCL 12是歸巢因子，BMP 2是促分化因子，但是兩種因子以何種比例聯(lián)用才能達(dá)到更好的治療效果，還需要更多高質(zhì)量的基礎(chǔ)研究及臨床研究來證實(shí)。

3.2 移植細(xì)胞存活率低

梗死區(qū)缺血缺氧和炎癥狀態(tài)會促使移植細(xì)胞死亡，從而降低干細(xì)胞對缺血性心臟病的治療效果。Bcl-2是細(xì)胞凋亡中最受關(guān)注的癌基因之一，它具有抑制凋亡的作用。LI等[11]使用Bcl-2基因?qū)SCs進(jìn)行基因改造，組裝成Bcl-2過表達(dá)MSCs，將Bcl-2-MSCs或單純MSCs移植到心肌梗死大鼠中，與MSCs組相比，Bcl-2-MSCs組在移植后4 d、3周和6周時細(xì)胞存活率分別增加了2.2倍、1.9倍和1.2倍。KITABAYASHI等[18]對梗死大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2修飾的骨骼肌成肌細(xì)胞組移植細(xì)胞存活時間延長，心肌纖維化減少，梗死區(qū)和邊緣區(qū)血管密度增加，心功能明顯改善。2項(xiàng)研究都支持Bcl-2能夠提高移植細(xì)胞抵御心肌梗死區(qū)惡劣環(huán)境的能力，但僅限于動物研究，在人體中是否有效還有待考證。

3.3 干細(xì)胞的增殖分化需要強(qiáng)化

單純的細(xì)胞移植后其轉(zhuǎn)分化率及表達(dá)結(jié)構(gòu)功能的程度并未達(dá)到人們的預(yù)期理想，因此人們開始傾力于對細(xì)胞的增殖分化有促進(jìn)作用的生長因子的研究。CHANG等[19]在左前降支閉塞的Sprague-Dawley大鼠心肌梗死模型中發(fā)現(xiàn)，移植后12周，脂肪源性成人干細(xì)胞聯(lián)合生長因子復(fù)合物(ADAS-GFS)移植組與ADAS移植組或?qū)φ战M比較，ADAS-GFS移植組梗死區(qū)周圍毛細(xì)血管增多，左心室功能明顯改善，與ADAS移植組或?qū)φ战M比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些數(shù)據(jù)表明生長因子能夠提高干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能。然而生長因子由于其易彌散而不能持久作用，以及如何與微環(huán)境中的移植細(xì)胞達(dá)到最有效的生物性結(jié)合又成為研究中懸而未解的問題。

3.4 干細(xì)胞治療的安全性問題

不少研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療存在安全隱患。GLEESON等[20]在全枸櫞酸血中添加間充質(zhì)干細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)動脈剪切時血小板在膠原蛋白上的血栓沉積，肝素聯(lián)合用藥可消除這一效應(yīng)；在豬急性心肌梗死模型中，在再灌注期間注入25×106間充質(zhì)干細(xì)胞后，冠狀動脈血流減少，聯(lián)用肝素可消除該效應(yīng)，說明MSCs有形成血栓的前活性，這對于心肌梗死患者來說是非常不利的。SIMINIAK等[21]將10例患者的自體骨骼肌成肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)3周后進(jìn)行移植，術(shù)后早期2例出現(xiàn)持續(xù)性室性心動過速，其余2例隨訪2周后發(fā)生持續(xù)性室性心動過速。還有學(xué)者認(rèn)為干細(xì)胞移植會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。GAO等[22]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)1例患者在注射細(xì)胞的過程中發(fā)生嚴(yán)重的冠狀動脈阻塞并發(fā)癥；LALU等[23]進(jìn)行的薈萃分析共收集了668項(xiàng)研究，其中23項(xiàng)符合資格標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞與急性不良事件之間無相關(guān)性，表明MSCs治療缺血性心臟病似乎是安全的。為進(jìn)一步明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的收益—風(fēng)險(xiǎn)狀況，有必要進(jìn)行精心設(shè)計(jì)、更大規(guī)模的隨機(jī)對照試驗(yàn)。

此外，還有骨髓干細(xì)胞自噬問題、分化的細(xì)胞能否長期維持心肌細(xì)胞功能等問題。

4 小結(jié)與展望

盡管目前治療急性心肌梗死的手段多樣，但AMI的預(yù)后欠佳，病死率仍然居高不下，是心血管領(lǐng)域亟需攻克的一大難題，需要找到新的治療方法來改變心肌梗死的預(yù)后。因此，國內(nèi)外學(xué)者試圖用干細(xì)胞移植來治療心肌梗死，目前已有大量臨床研究證實(shí)干細(xì)胞移植對于AMI的治療有一定的療效，但由于移植后分化率低、形成新的血栓、誘發(fā)心律失常、形成腫瘤，甚至有研究發(fā)現(xiàn)移植后并無改善心功能的作用等方面的問題，該治療方法尚未應(yīng)用于臨床。但是，筆者仍相信干細(xì)胞在心肌梗死治療領(lǐng)域的積極作用，并且預(yù)計(jì)該領(lǐng)域的迅速進(jìn)展和生物技術(shù)的進(jìn)步將解決這些問題，期待干細(xì)胞移植為心肌梗死的治療開辟一條新“通路”。