雷亞蘭，畢 儉，毛靖?jìng)?/p>

大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，遼寧 大連 116011

隨著肥胖、糖尿病等代謝疾病發(fā)病率日漸上升，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為全球公共衛(wèi)生問題。全球NAFLD平均患病率為25%，NAFLD及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)在美國(guó)患病率分別為30%和5%[1]。在我國(guó)，NAFLD患病率從2001年23.8%急劇上升到目前32.9%，正取代乙型肝炎成為慢性肝病的主要原因[2]。NAFLD與腸道免疫密切相關(guān)[3-4]，腸道免疫失衡促進(jìn)NAFLD肝臟炎癥、纖維化進(jìn)展，而NAFLD能夠引起腸道免疫紊亂[5]。通過腸肝循環(huán)以及免疫細(xì)胞募集、再循環(huán)，NAFLD與腸道免疫相互作用。本文就NAFLD對(duì)腸道免疫細(xì)胞的影響進(jìn)行系統(tǒng)性闡述，以期從腸道免疫角度為防治NAFLD尋找新的治療靶點(diǎn)，進(jìn)而延緩、甚至阻斷疾病進(jìn)展。

1 NAFLD對(duì)腸道免疫細(xì)胞的影響

1.1 NAFLD與腸道巨噬細(xì)胞 腸道巨噬細(xì)胞不僅在固有免疫中起作用，在適應(yīng)性免疫中也充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞角色。腸道處于炎癥狀態(tài)時(shí)，循環(huán)中大量單核細(xì)胞被招募至固有層，發(fā)育成巨噬細(xì)胞[6]，腸道巨噬細(xì)胞大都源于此。當(dāng)腸道受病原體侵襲，腸道黏膜層巨噬細(xì)胞通過Toll樣受體(TLR)清除病原體[7]。除此之外，黏膜層巨噬細(xì)胞也具備清除凋亡組織及免疫調(diào)節(jié)功能。

NAFLD與巨噬細(xì)胞的研究多聚焦于Kupffer細(xì)胞以及骨髓來源肝臟單核巨噬細(xì)胞，關(guān)于NAFLD與腸道巨噬細(xì)胞的報(bào)道較少。Tsujimoto等[8]發(fā)現(xiàn)，在NASH大鼠回腸組織中，包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞數(shù)量明顯增加，通過TLR4信號(hào)介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答增強(qiáng)，TNFα表達(dá)上調(diào)，說明腸道免疫和肝臟相互作用參與了NASH發(fā)生。Imajo等[9]也發(fā)現(xiàn)，NASH小鼠肝臟CD14及TLR4陽性巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，該類細(xì)胞對(duì)低劑量腸源性脂多糖呈現(xiàn)過度反應(yīng)。相關(guān)研究[10]說明，在NAFLD發(fā)病過程中，腸道固有免疫被激活，同時(shí)其下游肝臟固有免疫也呈現(xiàn)活化狀態(tài)，大量骨髓源性單核細(xì)胞被募集至肝臟，促進(jìn)肝臟炎癥、纖維化，而腸源性巨噬細(xì)胞在該過程中發(fā)揮重要作用。在諸如NAFLD的膽汁淤積發(fā)生過程中，腸道巨噬細(xì)胞通過炎癥小體的激活，促進(jìn)腸道通透性增加和腸道微生態(tài)改變，導(dǎo)致進(jìn)入肝臟的內(nèi)毒素增加，參與了膽汁淤積介導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡和炎癥。

腸道菌群對(duì)于維持巨噬細(xì)胞依賴的腸道免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，這一過程主要由短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid, SCFA)調(diào)控[11]。在NAFLD發(fā)病過程中，腸道菌群失調(diào)所致的SCFA含量異?？赡苁菍?dǎo)致腸道巨噬細(xì)胞數(shù)量及表型發(fā)生變化的機(jī)制之一。丁酸可以增加腸道巨噬細(xì)胞的氧自由基產(chǎn)生和抗菌物質(zhì)分泌，使其抗菌能力增強(qiáng)[12]。SCFA可以明顯下調(diào)NASH中腸道巨噬細(xì)胞的肝臟募集及肝臟炎癥反應(yīng)，SCFA改善NASH肝臟脂肪變性和炎癥，不僅與SCFA作用于肝臟巨噬細(xì)胞有關(guān)，也可能與調(diào)控腸道巨噬細(xì)胞有關(guān)[13]。

1.2 NAFLD與腸道樹突狀細(xì)胞(DC) DC是唯一能直接激活初始T淋巴細(xì)胞的專職抗原呈遞細(xì)胞。作為腸道專職抗原呈遞細(xì)胞的DC通過多種模式識(shí)別受體對(duì)腸道微生物群進(jìn)行識(shí)別和應(yīng)答[14]。DC在腸壁全層均有分布，除呈遞抗原外，還具備免疫調(diào)節(jié)功能，參與免疫耐受的誘導(dǎo)和維持[15]。

肝臟DC參與NAFLD的肝臟脂肪變性、炎癥及纖維化[16]。在慢性炎癥環(huán)境中，肝臟DC轉(zhuǎn)化為強(qiáng)效免疫反應(yīng)誘導(dǎo)物，參與肝脂質(zhì)沉積，是NAFLD進(jìn)展機(jī)制之一[17]。此外，某些肝臟DC亞型，如CD103+cDC以及CD11c+MHCⅡ+DC對(duì)NAFLD肝臟炎癥環(huán)境具有免疫調(diào)節(jié)作用，保護(hù)肝臟免受代謝性損傷[18-19]。有關(guān)NAFLD對(duì)腸道DC的影響，現(xiàn)有研究結(jié)論尚未統(tǒng)一。Tsujimoto等[8]發(fā)現(xiàn)，NASH大鼠回腸組織DC數(shù)量明顯增加，腸道固有免疫呈過度活化狀態(tài)。國(guó)內(nèi)學(xué)者[20]卻發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道DC與NAFLD發(fā)生發(fā)展相關(guān)，即在NAFLD早期階段，小腸DC數(shù)量明顯升高，隨著疾病進(jìn)一步發(fā)展，DC數(shù)量未再明顯變化。這一現(xiàn)象可能與以下原因有關(guān)：在NAFLD早期，腸道穩(wěn)態(tài)被破壞導(dǎo)致炎性抗原增多，負(fù)責(zé)腸道適應(yīng)性免疫應(yīng)答始動(dòng)階段的DC數(shù)目隨之增加，但隨著病情發(fā)展，腸道適應(yīng)性免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)換為效應(yīng)階段，腸道DC數(shù)量未再變化。筆者研究[21]發(fā)現(xiàn)，在單純性脂肪肝和NASH大鼠中，CD103+MHCⅡ+DC占腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph node, MLN)總細(xì)胞的比率較對(duì)照組明顯降低，并且該比率與疾病嚴(yán)重程度、門靜脈脂多糖水平呈相反的變化趨勢(shì)。該結(jié)論可能與MLN中大部分均為免疫細(xì)胞，DC變化的同時(shí)其他免疫細(xì)胞發(fā)生變化，并且變化幅度更大有關(guān)。

在NAFLD中，腸道屏障完整性受損以及腸道菌群紊亂與腸道DC失調(diào)密切相關(guān)。DC通過分泌IL-10，抑制輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，以此保護(hù)腸道屏障完整性[22]。另外，腸道菌群的代謝產(chǎn)物能夠調(diào)節(jié)腸道DC功能。有學(xué)者[23-24]發(fā)現(xiàn)，SCFA能夠調(diào)節(jié)單核細(xì)胞來源的DC表型分化、成熟過程和免疫功能，包括細(xì)胞因子分泌、抗原捕獲能力以及對(duì)T淋巴細(xì)胞的刺激作用。作為法尼酯受體激動(dòng)劑的次級(jí)膽汁酸能夠通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄通路調(diào)節(jié)腸道DC功能[25]。

1.3 NAFLD與腸道固有淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cells, ILC) ILC主要分布在腸道固有層，具有維持腸道穩(wěn)態(tài)和抵御病原體的功能。ILC表達(dá)多種細(xì)胞因子受體，但不表達(dá)抗原特異性受體，不會(huì)對(duì)病原體抗原直接做出反應(yīng)。ILC分為自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、1型ILC(ILC1)、2型ILC(ILC2)、3型ILC(ILC3)和淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞。

在肝臟組織中，NK細(xì)胞數(shù)量約占肝臟淋巴細(xì)胞30%～50%，分為組織固有NK細(xì)胞和循環(huán)NK細(xì)胞(circulated NK cells, cNK細(xì)胞)。肝臟CD49+NKp46+cNK細(xì)胞通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化來改善NASH纖維化[26]。Fan等[27]發(fā)現(xiàn)，肝臟cNK細(xì)胞增多可以改善肝臟CD45+CD11bhiF4/80int單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的炎癥浸潤(rùn)。當(dāng)腸道感染后，小腸NK細(xì)胞對(duì)病原體做出免疫應(yīng)答，通過分泌IFNγ發(fā)揮作用[28]。ILC2表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3，分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-13，在抗寄生蟲、組織修復(fù)和過敏反應(yīng)中發(fā)揮作用。Forkel等[29]發(fā)現(xiàn)，肝纖維化的肝組織內(nèi)ILC2數(shù)量增高，其表型與外周血ILC2不一致，其通過分泌IL-13激活肝星狀細(xì)胞促進(jìn)肝纖維化。ILC3是肝臟ILCs中占比最多的一類，且大量定居在腸道中。ILC3表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORγt并分泌淋巴毒素α1β2、IL-17A、IL-22、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和TNFα。肝纖維化過程中，肝臟IL-17A+及IL-22+ILC3亞型具有促纖維化作用[30]。有關(guān)NAFLD對(duì)腸道ILC的影響及調(diào)控尚未見系統(tǒng)報(bào)道。

1.4 NAFLD與腸道T淋巴細(xì)胞 腸道T淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原后，活化并遷移至MLN，經(jīng)淋巴或血液循環(huán)發(fā)育為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，分布于腸道和其他器官介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，小部分T淋巴細(xì)胞發(fā)育為記憶性T淋巴細(xì)胞。CD4+T淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫輔助作用，調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答；CD8+T淋巴細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用，且對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制的調(diào)節(jié)作用[31]。腸道T淋巴細(xì)胞主要定居于腸相關(guān)淋巴組織及MLN中，一部分CD8+T淋巴細(xì)胞分布于腸道上皮層。

在NAFLD發(fā)病過程中，侵入腸道的抗原能夠激活全身及腸道細(xì)胞免疫反應(yīng)。研究[32]發(fā)現(xiàn)，NAFLD外周血單個(gè)核細(xì)胞(periphera blood mononuclear cells, PBMC)及派伊爾結(jié)(Peyer’s Patch, PP)的CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化：在NAFLD早期階段，PBMC及PP中CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞比值均明顯增高，提示全身以及腸道細(xì)胞免疫應(yīng)答均處于增強(qiáng)狀態(tài)；隨著NAFLD進(jìn)展，比值呈下降趨勢(shì)，而門靜脈中脂多糖水平升高，提示機(jī)體免疫系統(tǒng)受損，炎癥范圍進(jìn)一步蔓延；當(dāng)進(jìn)展到NASH階段，PBMC中的CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比值和門靜脈中脂多糖的水平恢復(fù)正常，但是PP中該比值仍然是升高的，反映了腸道持續(xù)性的慢性炎癥狀態(tài)。研究者[33]還發(fā)現(xiàn)，NAFLD小鼠MLN內(nèi)包括Th1和Th17的CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量較正常對(duì)照組明顯增多，而Th2和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)數(shù)量卻顯著減少；進(jìn)一步分析其比例發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2和Th17/Treg均明顯升高。該研究提示，在NAFLD發(fā)病過程中，腸道促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)之間的微妙平衡被打破，腸道免疫處于失衡狀態(tài)。Jiang等[34]卻發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者的十二指腸組織固有層的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞較正?；颊呙黠@減少，而促炎因子TNF、IL-6和 IFNγ表達(dá)水平增高。該臨床研究結(jié)果與其他結(jié)果不一致，可能與血清脂多糖水平、物種、取材部位和疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。

作為腸道菌群代謝產(chǎn)物，SCFA對(duì)T淋巴細(xì)胞的生理活動(dòng)產(chǎn)生重大影響。丁酸刺激T淋巴細(xì)胞分化為Treg，乙酸和丙酸可以刺激常駐結(jié)腸組織Treg增殖[35]。在NAFLD中，腸源性內(nèi)毒素血癥引起循環(huán)及肝臟內(nèi)毒素水平升高，當(dāng)內(nèi)毒素被巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞呈遞給初始CD4+T淋巴細(xì)胞后，能夠上調(diào)IL-17表達(dá)，這可能是腸道及肝臟Th17數(shù)量增加的機(jī)制之一，而肝臟中增高的Th17促進(jìn)NAFLD肝臟炎癥及纖維化，加速單純性脂肪肝向NASH轉(zhuǎn)變[36-37]。相比于骨髓、脾臟和胸腺源性的淋巴細(xì)胞，腸源性CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞更趨向于再循環(huán)至肝臟，通過分泌炎癥因子和刺激吞噬細(xì)胞分化等途徑介導(dǎo)肝臟炎癥反應(yīng)，促進(jìn)NAFLD病程發(fā)展，這可能與肝細(xì)胞趨化因子CCL5表達(dá)升高以及MLN內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞及CD19+B細(xì)胞淋巴表面CCR3高表達(dá)有關(guān)[38]。

1.5 NAFLD與腸道B淋巴細(xì)胞 腸道B淋巴細(xì)胞骨髓源性B2細(xì)胞和由腹腔遷移而來的B1細(xì)胞。與B1細(xì)胞產(chǎn)生的非T淋巴細(xì)胞依賴性IgA相比，B2細(xì)胞產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞依賴性IgA在與抗體結(jié)合時(shí)具有更高特異性和親和能力[39]。在NAFLD中，肝臟B淋巴細(xì)胞常發(fā)生在T淋巴細(xì)胞活化之前，通過產(chǎn)生炎癥介質(zhì)和抗體促進(jìn)肝小葉的炎癥及纖維化，加快病程發(fā)展[40]。在腸道抗原刺激下，肝臟B淋巴細(xì)胞的IgA進(jìn)入腸道，同時(shí)腸源性產(chǎn)IgA的B淋巴細(xì)胞至肝臟，參與肝臟體液免疫[41]。通過腸肝循環(huán)，肝臟及腸道B淋巴細(xì)胞交集。

關(guān)于NAFLD與腸道B淋巴細(xì)胞究非常少，更多研究是關(guān)于NAFLD和腸道IgA之間的關(guān)系。在NAFLD中，腸道IgA水平明顯降低，其變化可能與腸源性內(nèi)毒素血癥、疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。Li等[42]發(fā)現(xiàn)，NASH大鼠腸道黏液中的SIgA水平明顯降低，門靜脈中內(nèi)毒素水平升高，兩者呈負(fù)相關(guān)。NASH小鼠的糞便標(biāo)本中IgA水平明顯降低，回結(jié)腸組織中IgA陽性細(xì)胞也明顯減少，但在單純性脂肪肝階段，小鼠糞便IgA水平和回結(jié)腸IgA陽性細(xì)胞數(shù)量相對(duì)于對(duì)照組并無顯著差異，這似乎表明NAFLD腸道IgA水平與疾病嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)，糞便IgA水平可以預(yù)測(cè)疾病嚴(yán)重程度[43]。然而血清IgA水平與NAFLD嚴(yán)重程度正相關(guān)，即隨著NAFLD病情加重，血清IgA水平也隨之升高[44]。

腸道IgA能夠影響腸道菌群變化，而腸道IgA也受腸道菌群調(diào)控[45]。在缺乏B淋巴細(xì)胞的糞便中，腸肝菌科數(shù)量明顯增加[46]。將低糞便IgA水平小鼠和高糞便IgA水平小鼠共同飼養(yǎng)或者通過糞便移植的方式使腸道菌群垂直轉(zhuǎn)移后，高糞便IgA小鼠的糞便IgA水平明顯降低[47]，提示腸道IgA水平受腸道菌群調(diào)節(jié)。益生菌通過提高腸道IgA水平以及腸黏膜內(nèi)IgA陽性細(xì)胞數(shù)量來改善腸道免疫紊亂，緩解NAFLD病程[43]。NAFLD腸道IgA下降，腸道埃希氏桿菌屬(屬于腸桿菌科)豐度卻較對(duì)照組明顯增加[34]。與正常及肥胖兒童相比較，在綱水平上，NAFLD兒童腸道變形菌(腸桿包含菌科)明顯增多[48]。據(jù)此推測(cè)，NAFLD腸道IgA水平可能與腸桿菌科失衡相關(guān)。

腸道菌群代謝產(chǎn)物SCFA與腸道IgA水平也密切相關(guān)。人糞便中的丁酸濃度與IgA水平呈正相關(guān)，丁酸能夠增強(qiáng)IgA免疫效應(yīng)[49]。SCFA能夠調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞代謝，如增加氧化磷酸化、糖酵解及游離脂肪酸合成，使得線粒體產(chǎn)生更多能量參與B淋巴細(xì)胞、分化和抗體生成[50]。NAFLD的腸道B淋巴細(xì)胞IgA水平的變化可能受上述機(jī)制所影響。

2 以腸道免疫為靶點(diǎn)治療NAFLD

從腸道免疫的角度治療NAFLD已成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。一些藥物可以通過口服給藥途徑靶向調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)，進(jìn)而改善NAFLD。現(xiàn)階段抗CD3單克隆抗體、PRX106(重組抗TNFα融合蛋白)已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

抗CD3單克隆抗體(anti-CD3 monoclonal antibody, Anti-CD3 mAb)口服后不被腸道吸收，但能夠影響腸道免疫，將免疫信號(hào)傳遞至全身免疫系統(tǒng)。Anti-CD3 mAb口服后被固有層中的DC攝取，隨DC遷移至MLN誘導(dǎo)Treg的分化，從而調(diào)節(jié)全身免疫狀態(tài)。口服Anti-CD3 mAb誘導(dǎo)Treg和NKT淋巴細(xì)胞抑制炎癥反應(yīng)，減少肝臟脂質(zhì)蓄積、減輕炎癥改善、病情[51]。健康志愿者及NASH患者在口服Anti-CD3 mAb后有良好安全性、耐受性以及生物活性[52]。

PRX106是一種重組抗TNFα融合蛋白，口服后不被胃腸道吸收，能夠改善免疫相關(guān)的肝臟損傷和結(jié)腸炎，該過程與CD4+CD25+Foxp3+Treg分布有關(guān)[53]?？诜RX106可以降低NASH小鼠的血清甘油三酯、葡萄糖、胰島素和AST水平，改善肝損傷[54]。在此過程中，腸道免疫信號(hào)對(duì)肝臟免疫系統(tǒng)乃至全身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，具體機(jī)制尚不清楚。臨床試驗(yàn)表明健康志愿者口服PRX106后有良好的安全性、耐受性以及生物活性[55]。

3 問題與展望

目前，有關(guān)NAFLD發(fā)病中腸道免疫系統(tǒng)變化的趨勢(shì)、機(jī)制尚未明確，大部分研究結(jié)論均建立在NAFLD模型基礎(chǔ)之上，其與真實(shí)世界的一致性仍面臨重大挑戰(zhàn)。在NAFLD中腸道免疫系統(tǒng)失衡是存在的，不同免疫細(xì)胞變化伴隨著疾病發(fā)展與全身免疫系統(tǒng)紊亂，其中腸道菌群紊亂可能是NAFLD中腸道免疫紊亂的機(jī)制之一。目前NAFLD尚無特效藥物，而腸道免疫細(xì)胞作為NAFLD的治療靶點(diǎn)，具有較好的前景，其中Anti-CD3 mAb和PRX106的口服給藥可以通過調(diào)節(jié)腸道局部的免疫環(huán)境，進(jìn)而改善全身免疫環(huán)境及肝臟的免疫環(huán)境來治療NAFLD。

總之，腸道免疫失衡參與了NAFLD發(fā)生與發(fā)展，探究腸道免疫的角色有助于對(duì)NAFLD發(fā)病機(jī)制以及治療的研究，而口服免疫制劑的應(yīng)用為治療NAFLD提供了新手段。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：雷亞蘭負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，撰寫論文；畢儉負(fù)責(zé)參與修改論文；毛靖?jìng)ヘ?fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。