牛曉慶 林兆威 楊德潔 孟秀利 唐慶華 宋薇薇

摘 ?要：為查明海南省萬寧市由檳榔隱癥病毒1（Areca palm velarivirus 1， APV1）引起的檳榔黃葉病毒病發(fā)生情況，2020年9—11月，對該市13個鄉(xiāng)鎮(zhèn)（區(qū)）的黃化檳榔園進(jìn)行調(diào)查、采樣，共采集檳榔葉片1454份。利用RT-PCR技術(shù)對所采集樣品進(jìn)行了APV1檢測，并對攜帶病毒的檳榔葉片癥狀進(jìn)行歸類整理。結(jié)果顯示，由APV1引起的檳榔病毒病發(fā)生普遍，最低檢出率為75%，最高檢出率最達(dá)100%;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，感染APV1的檳榔葉片癥狀主要有6種類型。本研究結(jié)果可為萬寧市檳榔病毒病的識別與防控提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：檳榔;檳榔長線形病毒;調(diào)查;癥狀識別

中圖分類號：S435.671 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： The objectives of this study is to investigate the occurrence of areca plan leaf yellowing virus disease caused by Areca palm velarivirus 1 （APV1） in Wangning， Hannan， China. During September to November 2020， all betel palm planting areas from 13 towns of Wanning were investigated and a total of 1454 leaf samples were collected and further detected by the RT-PCR method. The results showed that APV1 seemed to be the dominating pathogens affecting betel palm， with a detection rate from 75% to 100%. Meanwhile， the symptoms in betel palm infected by APV1 could be grouped into six different types. The results reported in this study would provide useful insights in the identification， prevention and control of the viral disease of betel palm.

Keywords： Areca catechu L.; Areca palm velarivirus 1; investigation; symptom identification

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.004

檳榔（Areca catechu L.），是多年生常綠喬木，屬棕櫚科中的檳榔亞科，主要分布于中國、柬埔寨、東非、埃及、印度、馬來西亞、阿拉伯半島等熱帶和亞熱帶地區(qū)。在中國，檳榔位列“四大南藥”之首，具有抗炎癥、治療水腫、脾胃疼痛、驅(qū)寄生蟲、抗真菌、抑制流行性感冒等效果[1-5]，其藥用價值在我國已有1000多年的歷史。其中，海南檳榔種植面積占全國的95%以上，目前是海南省僅此于橡膠的第二大熱帶經(jīng)濟(jì)作物[6]，也是海南省政府重點(diǎn)發(fā)展的“三棵樹”（橡膠、檳榔、椰子）之一。

海南省萬寧市是著名的“中國檳榔之鄉(xiāng)”“國家檳榔示范基地”，素有“海南檳榔半萬寧”之稱，種植面積約占海南省的四分之一。但近些年來，檳榔病蟲害問題日趨嚴(yán)重，黃化現(xiàn)象對萬寧檳榔產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重威脅，讓廣大種植戶恐懼、甚至“談黃色變”。其中檳榔黃化?。▂ellow leaf disease， YLD）是目前嚴(yán)重影響檳榔生長和產(chǎn)量的一種傳染性病害[7-8]，病害癥狀主要表現(xiàn)為初期時中間和下層的葉片開始逐漸變?yōu)榕c綠色部分具有明顯界限的黃色，然后開始往上蔓延，最終使得整個植株的葉片變黃、葉片變得硬而短又脆，心葉變小，并且部分出現(xiàn)畸形，最終導(dǎo)致果實(shí)和葉片的脫落而死亡[9]。我國海南檳榔黃化病最早發(fā)現(xiàn)于1981年海南省的屯昌縣境內(nèi)的檳榔種植園，面積僅6.67 hm2[10]，之后隨著檳榔種植面積的擴(kuò)大，檳榔黃化病也隨著種植地區(qū)而開始蔓延，逐漸引起了人們的重視，羅大全等[11-13]通過巢式PCR和電鏡技術(shù)鑒定出檳榔黃化病由植原體引起。2015年Yu等[14-15]等在檳榔黃化葉片中通過RNAseq發(fā)現(xiàn)了檳榔長線形病毒（Areca palm velarisvirus 1， APV1），并報(bào)道了其全長基因組。2020年，Wang等[16]通過對海南省部分市（縣）檳榔黃化葉片進(jìn)行病原檢測，確定APV1是檳榔黃化現(xiàn)象的病害因子之一，并在檳榔園中發(fā)生流行。為進(jìn)一步摸清APV1在萬寧市檳榔黃化病園的發(fā)生情況，本研究團(tuán)隊(duì)以萬寧為切入點(diǎn)，首次對萬寧13個鄉(xiāng)鎮(zhèn)（區(qū)）的檳榔黃化病園的APV1進(jìn)行檢測鑒定，同時對感染APV1的檳榔葉片癥狀進(jìn)行了分類統(tǒng)計(jì)，摸清由APV1引起的檳榔黃葉病毒病的發(fā)生情況，可為該病害的田間診斷和科學(xué)防控奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料和方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?采樣材料 ?15 m勾刀、采樣袋、大塑料袋、枝剪、記號筆、中性筆、紙巾、寫字板、草帽、酒精、蚊香。

1.1.2 ?主要試劑與儀器 ?主要試劑：RNAprep Pure多酚多糖植物總RNA提取試劑盒（DP441）、反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成試劑盒（MR05101M）、2×Taq PCR mix購于天根生化科技（北京）有限公司。主要儀器：Bio-Rad T100 PCR儀器、干式恒溫器（DTH-100）、凝膠電泳儀，高速低溫組織研磨儀（KZ-III-F），全球定位系統(tǒng)（GPS）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?采樣方法 ?采用隨機(jī)法[17]，對萬寧市興隆區(qū)、南橋鎮(zhèn)、三更羅鎮(zhèn)、萬城鎮(zhèn)、后安鎮(zhèn)、和樂鎮(zhèn)、龍滾鎮(zhèn)、長豐鎮(zhèn)、北大鎮(zhèn)等13個鄉(xiāng)鎮(zhèn)（區(qū)），共計(jì)149個村委會（農(nóng)場）的黃化病園疑似樣品進(jìn)行采樣。使用酒精擦拭后的勾刀取發(fā)病園檳榔葉片1～2個裂葉，放于自封袋內(nèi)，標(biāo)記時間、地點(diǎn)、編號，并做GPS記錄，當(dāng)天采樣當(dāng)天送回，用于室內(nèi)病毒病檢測。

1.2.2 ?樣品處理 ?剪取檳榔黃化葉片樣品，稱取0.1 g，大小為2 mm×5 mm的若干小塊，于無酶無菌處理的1.5 mL離心管中，每管放3粒直徑3 mm的無酶無菌鋼珠，做好標(biāo)記，按順序置于24孔或48孔研磨鋼槽中，迅速置于–80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ?RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA合成 ?利用RNAprep Pure多酚多糖植物總RNA提取試劑盒，參照說明書，提取樣品總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成試劑盒，將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ?RT-PCR檢測 ?利用Wang等[16]設(shè)計(jì)的5對APV1的鑒定引物（表1），對所采集檳榔疑似樣品進(jìn)行PCR檢測。本實(shí)驗(yàn)先對5對引物進(jìn)行擴(kuò)增效率測定，然后用測定的最佳引物先進(jìn)行疑似樣品擴(kuò)增。反應(yīng)擴(kuò)增體系：cDNA模板2.0 μL、Taq PCR mix預(yù)混液17 μL、上下游引物各0.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性15 s;退火時間30 s;72 ℃延伸1 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，用于瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴(kuò)增片段的大小。對擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳，隨機(jī)選取陽性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 ?APV1檢出率統(tǒng)計(jì)及黃化癥狀歸類 ?將1.2.1和1.2.2采集和處理的檳榔葉片樣品，進(jìn)行APV1檢測。按下列公式計(jì)算病毒檢出率：R= n/N×100%。式中，R為病毒檢出率，n為陽性樣品數(shù)，N為檢測樣品總數(shù)。

對采集的樣品，在剪取之前，根據(jù)采樣時間、地點(diǎn)和編號進(jìn)行拍照留底，再將檢出陽性的樣品對照編號進(jìn)行癥狀區(qū)分和歸類整理，總結(jié)出檢測到APV1的檳榔葉片癥狀類型。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?對引物進(jìn)行擴(kuò)增效率分析

如圖1所示，泳道“24”“48”陰性對照無污染，比較各引物對的擴(kuò)增效率，其中較好的為YLDV2-F/YLDV2-R和YLDV4-F/YLDV4-R，擴(kuò)增效率最差的為YLDV1-F/YLDV1-R和YLDV5- F/YLDV5-R，其次是YLDV3-F/YLDV3-R。由圖中顯示，泳道“23”中，僅YLDV5-F/YLDV5-R擴(kuò)出，說明5對引物擴(kuò)增效率表現(xiàn)出一定的差異。對YLDV5-F/YLDV5-R擴(kuò)出的泳道“23”中樣品和5對引物中隨機(jī)選擇4個帶有目的條帶的樣品送測序，將測序結(jié)果在NCBI中BLASTn比對，比對結(jié)果顯示，檢測樣品均為APV1。由于YLDV4-F/YLDV4-R長度為500 bp，擴(kuò)增片段比YLDV2-F/YLDV2-R長，表現(xiàn)更多的遺傳信息和擴(kuò)增效率，因此優(yōu)先使用YLDV4-F/YLDV4-R作為應(yīng)用引物，對未擴(kuò)增出的樣品使用YLDV2- F/YLDV2-R和YLDV5-F/YLDV5-R檢測。

2.2 ?病毒檢出率統(tǒng)計(jì)

本次調(diào)查共采集成齡檳榔葉片樣品1454份（每株樹采集1份樣品）、檳榔苗圃葉片140份。樣品的檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表2，其中興隆區(qū)、長豐鎮(zhèn)、東奧鎮(zhèn)共264份樣品，APV1檢出率為100.00%;南橋鎮(zhèn)、禮紀(jì)鎮(zhèn)、三更羅鎮(zhèn)共351份檳榔葉片，APV1平均檢出率為96.04%;其余鎮(zhèn)的病毒檢出率均在80%以上，和樂鎮(zhèn)最低，60份樣品的檢出率為75%，其次是山根鎮(zhèn)，檢出率為78.79%;1454份檳榔葉片樣品中，共檢出病毒樣品1297份，檢出率為89.20%（表2）。通過對萬寧各鄉(xiāng)鎮(zhèn)APV1檢出率的統(tǒng)計(jì)，更直觀展現(xiàn)APV1在萬寧檳榔上的發(fā)生危害情況（圖2）。此次調(diào)研中，也對萬寧部分檳榔苗圃進(jìn)行了病毒檢測，共檢測了1齡苗、2齡苗共28份，有17份帶毒，檢出率達(dá)60%。

2.3 ?APV1的檳榔葉片癥狀

對采集的1454份疑似樣品進(jìn)行APV1檢測，通過檢測結(jié)果并對比采集的照片，將感染APV1的黃化癥狀進(jìn)行歸類。與健康檳榔葉片對比發(fā)現(xiàn)，檳榔黃化葉片類型主要有以下幾種：不均勻黃化、黃綠相間、葉肉與葉脈黃化或葉脈黃化、葉尖表現(xiàn)黃化、斑駁黃化（圖3），均為田間黃化常見癥狀，檳榔黃化病園里的這些癥狀均可檢測到APV1。

3 ?討論

檳榔黃化病是嚴(yán)重威脅檳榔產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的一種傳染性病害[18]。檳榔黃化病逐年加重，輕者減產(chǎn)10%～20%，重者減產(chǎn)50%～60%，局部地區(qū)造成毀種失收，給海南檳榔種植戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響海南農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。一些學(xué)者[9-13]通過巢式PCR、電鏡技術(shù)檢測鑒定認(rèn)為檳榔黃化病主要由植原體引起。雖然相對于植原體引起的黃化而言，APV1是新發(fā)現(xiàn)的病原，但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)該病毒與檳榔黃化病的發(fā)生與流行密切相關(guān)[16]，本調(diào)查研究結(jié)果與其觀點(diǎn)一致;本調(diào)研結(jié)果同時表明萬寧市檳榔黃葉病毒病危害嚴(yán)重，發(fā)生率高、發(fā)生面積廣，遍及萬寧各鄉(xiāng)鎮(zhèn)（區(qū)），在所有的病原采集點(diǎn)都能檢測到APV1。本文在黃化病園采集的13個鄉(xiāng)鎮(zhèn)（區(qū)）共1454份黃化類型葉片中，APV1檢出率最高達(dá)100%，最低也有75%，平均檢出率為89.2%，這些數(shù)據(jù)表明，APV1可能是引起檳榔黃化的主要病毒之一。但依然需要完成柯赫氏法則來進(jìn)一步證實(shí)這一論斷，因病毒很難體外活體培養(yǎng)，難以進(jìn)行遺傳操作，且APV1傳播媒介飼養(yǎng)條件不完善，可通過構(gòu)建侵染性克隆的方法進(jìn)行驗(yàn)證和開展相關(guān)功能基因的研究[19-21]。

至于該病毒何時開始在海南省檳榔上發(fā)生，發(fā)生之后如何傳播擴(kuò)散，發(fā)生擴(kuò)散期間是否發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化？這些重要科學(xué)問題目前均未得到解析。本文在檳榔苗圃中也檢測到帶有該病毒，可見檳榔苗期就可以攜帶APV1，很可能在生長至一定結(jié)果年限，才影響了檳榔長勢和產(chǎn)量及外在表現(xiàn)，也可能在結(jié)果期染病，從小苗帶毒到影響結(jié)果需要多長時間，還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證?？傊珹PV1的研究仍處于初始階段，其傳播媒介不清楚，傳播機(jī)理尚不明確，發(fā)生規(guī)律也無相關(guān)報(bào)道。眾所周知，大約80%的植物病毒依賴?yán)ハx介體進(jìn)行傳播[22-23]。蟲媒病害的發(fā)生與流行和介體昆蟲的活動密不可分，“病毒-昆蟲-植物”三者互作決定了病蟲害的流行發(fā)生和嚴(yán)重程度[24]。由昆蟲傳播的植物病毒病每年造成的作物損失達(dá)幾十億美元，其中飛虱、蚜蟲、木虱、粉虱、葉蟬、蠟禪和薊馬等昆蟲是植物病毒病的主要傳播介體[25]，因此，切斷昆蟲介體傳播途徑，是控制植物病毒病最行之有效的方法;其次是種植健康檳榔苗，檢測到長線形病毒的檳榔苗圃，應(yīng)謹(jǐn)慎銷售，隨著科技的蓬勃發(fā)展，檳榔脫毒苗有望占領(lǐng)市場;檳榔種果是否帶毒，目前尚無報(bào)道，還處于研究階段，但是仍應(yīng)該選擇健康檳榔園制種，并建立隔離苗圃，以絕后患。

因?yàn)锳PV1是新發(fā)現(xiàn)的引起檳榔黃化的病原，有必要摸清其危害癥狀。本文檢測觀察發(fā)現(xiàn)，該病毒病的癥狀并不單一，即出現(xiàn)了同一病毒引起不同癥狀的現(xiàn)象，除與報(bào)道的植原體病害癥狀[11， 15]有相似之處外，也有其他癥狀，比如檳榔葉尖黃化、主脈及葉肉黃化、葉脈黃化、水漬狀暗綠點(diǎn)黃化、葉脈兩側(cè)不規(guī)則褪綠似橡皮擦過狀等。說明病毒病癥狀的復(fù)雜性，病毒與癥狀之間的相互關(guān)聯(lián)并不是絕對的，癥狀可以改變，而且很大程度上取決于寄主植物及感病時間的長短、病毒種類和環(huán)境條件等[26]。而且病毒癥狀的發(fā)展有個過程，有些植物病毒侵染植物后，前期癥狀和后期癥狀可能完全相同，也可能完全不同，且整個發(fā)展過程沒有明顯的界限。例如煙草花葉病毒（TMV）感染的普通煙，最初葉片出現(xiàn)明脈癥，一兩天后很快發(fā)展成斑駁癥，再過幾天就發(fā)展成典型的花葉癥，花葉癥又可從輕花葉發(fā)展成重花葉[27]。6種檢測到APV1的葉片癥狀中，在健康的2齡檳榔園發(fā)現(xiàn)有斑駁似西瓜皮樣癥狀，但沒有檢測到APV1，說明這種癥狀葉片本身不攜帶該病毒，此種癥狀可能是缺素或者其他病因引起;而在成齡發(fā)病檳榔園里的斑駁黃化能檢測到APV1，說明斑駁是在APV1侵染之前就存在，只是因APV1侵染，葉片變得發(fā)黃。而且在檳榔黃化園里，有些健康葉片中也檢測到了APV1，說明該病毒具有隱癥屬性。然而由APV1引起的檳榔葉片癥狀是如何發(fā)展變化的，還需要進(jìn)一步深入研究。

本文首次報(bào)道了海南萬寧由APV1引起的檳榔黃葉病毒病的發(fā)生情況和癥狀識別，明確了萬寧APV1的發(fā)生危害現(xiàn)狀。后續(xù)將從時間和空間尺度上對APV1的發(fā)生和流行等重要進(jìn)程進(jìn)行量化分析，推斷APV1的最近共祖時間及起源點(diǎn)，并探明非生物的地理因素對該病毒適應(yīng)性進(jìn)化的影響，進(jìn)一步闡明APV1的分子流行規(guī)律，為制定其防控策略、阻斷該病毒的流行提供理論依據(jù)，也可為其他病毒病原的相關(guān)研究提供重要的參考。

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責(zé)任編輯：謝龍蓮