褚晨亮，王馨晨，鄭 靜，路 寬，黃 函，覃 亮

(1.肇慶學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，廣東 肇慶 526061；2.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.肇慶學(xué)院 教學(xué)評(píng)估與督導(dǎo)中心，廣東 肇慶 526061)

三椏苦Melicopeptelefolia(Champ.ex Benth) Hartley是蕓香科蜜茱萸屬植物，又稱(chēng)三丫苦、三叉苦、三枝槍等，始載于《嶺南采藥錄》，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕的功效，臨床上用于多種疾病的治療[1]。以三椏苦藥材為主藥，開(kāi)發(fā)了三九胃泰、三九感冒靈等中成藥。三椏苦藥材主要含有揮發(fā)油和生物堿[2]，生物堿類(lèi)化合物具有抗腫瘤活性[3-6]，文獻(xiàn)報(bào)道從三椏苦藥材中分離得到多種生物堿[7]，但是目前對(duì)其抗腫瘤活性及其機(jī)制的研究較少，為進(jìn)一步研究三椏苦生物堿類(lèi)成分，闡述其抗腫瘤活性機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)利用生物堿富集方法，從三椏苦莖的乙醇提取物中富集、初步分離得到8個(gè)生物堿，鑒定為吳茱萸春堿、茵芋堿、香草木寧堿、白鮮堿、4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline、4-methoxy-2(1H)-quinolinone、R-(+)-platydesmin、7-羥基白鮮堿，以人肝癌細(xì)胞HepG-2、胃癌細(xì)胞BGC為研究對(duì)象，采用CCK-8法分別進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選，并利用分子對(duì)接技術(shù)闡述具有體外抗腫瘤活性的生物堿類(lèi)成分抗腫瘤機(jī)制，這有利于闡明其有效成分，為醫(yī)藥企業(yè)對(duì)該藥材進(jìn)行深入開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000(上海亞榮儀器有限公司)，NMR(Bruker 400 ASCENDTM)。乙酸乙酯、乙醇(95%)、二氯甲烷、氯仿、甲醇(均為分析醇，購(gòu)自天津富宇精細(xì)化工有限公司)，硅膠(青島海洋化工廠)，ODS柱色譜填料(Merck，德國(guó))，Sephadex LH-20 柱(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞士)，肝癌細(xì)胞HepG-2、胃癌細(xì)胞BGC(廣東省中醫(yī)科學(xué)研究院)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))，胎牛血清(FBS，Hyclone，美國(guó))，TransDetect Cell Counting Kit(CCK)，貨號(hào)：FC101-04，北京全式金生物科技有限公司。喜樹(shù)堿為陽(yáng)性對(duì)照品(CDGO-100532，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

三椏苦于2019年6月采集于肇慶鼎湖山。原植物經(jīng)廣東藥科大學(xué)劉基柱教授鑒定為蕓香科蜜茱萸屬植物三椏苦，保存在肇慶學(xué)院理工樓C608室(SYK-0618)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取和分離

取干燥的三椏苦莖枝粗粉30 kg，用95%乙醇冷浸提取3次(120 L×3)，每次提取2 d，合并提取液，減壓濃縮，揮干剩余溶劑，得到乙醇提取物(2.6 kg)。三椏苦乙醇提取物(2.6 kg)用5%HCl水溶液捏溶，過(guò)濾，濾液用濃氨水調(diào)節(jié)pH=10，氯仿萃取6次，合并萃取液，濃縮，得粗生物堿1(79.0)g；堿水層繼續(xù)用NaOH調(diào)節(jié)pH=13，用氯仿萃取6次，合并萃取液，濃縮，得粗生物堿2(4.5 g)，根據(jù)薄層色譜結(jié)果將粗生物堿1和粗生物堿2合并，得粗生物堿(83.5 g)。

取粗生物堿(80.0 g)，3.5 g留樣，經(jīng)硅膠(100～200目)柱色譜分離，二氯甲烷：乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到18個(gè)流分(Fr.1～18)，F(xiàn)r.2(2.5 g) 經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到6個(gè)流分(Fr.2.1～2.6)，F(xiàn)r.2.2(32.5 mg)經(jīng)葡聚糖凝膠色譜純化，得到化合物1(20.2 mg)；Fr.2.3(102.5 mg))經(jīng)硅膠(300～400目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到化合2(22.5 mg)；Fr.2.5(152.3 mg)經(jīng)硅膠(300～400目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到5個(gè)流份(Fr.2.5.1～2.5.5)，F(xiàn)r.2.5.3(19.5 mg)經(jīng) Rp-18(MeOH∶H2O 70∶30)純化，得到化合物3(14.6 mg)；Fr.2.5.5(39.5 mg))經(jīng)sephadexLH-20(CHCl3∶MeOH 30∶70))純化，得到化合物4(15.3 mg)；Fr.3(4.2 g) 經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到10個(gè)流份(Fr.3.1～3.10)，F(xiàn)r.3.7(202.3 mg))經(jīng)硅膠(300～400目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到6個(gè)流份(Fr.3.7.1～3.7.3)，F(xiàn)r.3.7.4(40.4 mg))經(jīng) Rp-18(MeOH∶H2O 60∶40)純化，得到化合物5(28.6 mg)；Fr.3.7.6(15.8 mg) 經(jīng) Rp-18(MeOH∶H2O 60∶40)純化，得到化合物6(9.6 mg)；Fr.4(3.5g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到7個(gè)流份(Fr.4.1～4.7)，F(xiàn)r.4.5(72.5 mg)經(jīng)硅膠(300～400目)柱色譜分離，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到3個(gè)流份(Fr.4.5.1～4.5.3)，F(xiàn)r.4.5.3(18.4 mg)經(jīng) Rp-4-18(MeOH∶H2O 60∶40)純化，得到化合物7(10.5 mg)；Fr.4.7(23.8 mg) 經(jīng) Rp-18(MeOH∶H2O 60∶40)純化，得到化合物8(11.5 mg)。

2.2 體外抗腫瘤活性篩選

利用CCK-8法體外測(cè)定8個(gè)生物堿對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2、胃癌細(xì)胞BGC的抑制率。肝癌細(xì)胞HepG-2、胃癌細(xì)胞BGC分別用1640培養(yǎng)基(加10%胎牛血清、100μg·L-1青霉素和100μg·L-1鏈霉素)培養(yǎng)于5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱。在96孔板中接種100μL的細(xì)胞懸液(每孔2×103個(gè)細(xì)胞)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求在37度、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。加入不同濃度(5、12.5、25、50、100μm/L)的化合物(1～8)處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，每孔中加入11μL的CCK 溶液，在二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD，重復(fù)6次，記錄OD值并計(jì)算各待測(cè)化合物的抑制率，利用SPSS軟件計(jì)算IC50，設(shè)計(jì)細(xì)胞對(duì)照和培養(yǎng)基本底對(duì)照。

2.3 抗腫瘤機(jī)制研究

文獻(xiàn)研究表明，能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞凋亡的途徑包括死亡受體途徑、線粒體途徑、阻滯細(xì)胞周期途徑等[8]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)查閱與這兩個(gè)腫瘤細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)的蛋白靶點(diǎn)，明確肝癌細(xì)胞HepG-2、胃癌細(xì)胞BGC相關(guān)分子對(duì)接的靶點(diǎn)，即Caspase-3，VEGF-2，MMP-9，CDK四個(gè)靶點(diǎn)，以四個(gè)靶點(diǎn)分別對(duì)接8個(gè)化合物來(lái)進(jìn)行抗腫瘤機(jī)制研究。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3) δ：7.52(1H，d，J=2.9Hz，H-2)，7.01(1H，d，J=3 Hz，H-3)，4.40(3H，s，4-OMe)，3.93(3H，s，7-OMe)，8.12(1H，d，J=9.1 Hz，H-5)、δ7.06(1H，dd，J=9.1，2.3 Hz，H-6)、δ7.31(1H，d，J=2.3 Hz，H-8)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：164.6(C-8b)，161.0(C-7)，156.8(C-4)，147.6(C-8a)，142.5(C-2)，123.6(C-5)，116.8(C-6)，113.5(C-4a)，106.0(C-8)，105.0(C-3)，101.9(C-3a)，58.8(4-OMe)，55.3(7-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致[9]，故鑒定化合物1為吳茱萸春堿。

化合物2：淡黃色針晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3) δ：7.53(1H，d，J=2.7 Hz，H-2)，δ7.00(1H，d，J=2.7 Hz，H-3)，4.39(3H，s，4-OMe)，4.00(3H，s，7-OMe)，4.07(3H，s，8-OMe)，7.96(1H，d，J=9.2 Hz，H-5)，7.20(1H，d，J=9.2 Hz，H-6)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)，δ：164.0(C-8b)，157.2(C-4)，152.2(C-8)，143.1(C-2)，142.0(C-7)，141.6(C-8a)，118.2(C-5)，115.0(C-4a)，112.2(C-6)，104.5(C-3)，102.0(C-3a)，61.6(8-OMe)，59.0(4-OMe)，56.9(7-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致[10]，故鑒定化合物2為茵芋堿。

化合物3：淡黃色針晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.51(1H，d，J=2.6 Hz，H-2)，δ7.01(1H，d，J=2.6 Hz，H-3)，4.39(3H，s，4-OMe)，3.99(3H，s，6-OMe)，3.99(3H，s，7-OMe)，7.40(1H，s，H-5)、7.29(1H，s，H-8)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：163.1(C-8b)，155.6(C-4)，152.7(C-7)，147.7(C-6)，142.6(C-8a)，142.5(C-2)，113.0(C-4a)，106.6(C-8)，104.7(C-3)，102.3(C-3a)，100.3(C-5)，58.6(4-OMe)，56.0(6-OMe)，56.0(7-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致[10]，故鑒定化合物3為香草木寧堿。

化合物4：淺黃色粒狀結(jié)晶(CHCl3)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.61(1H，d，J=2.7 Hz，H-2)，δ7.05(1H，d，J=2.7 Hz，H-3)，4.43(3H，s，4-OMe)，8.25(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，7.45(1H，t J=7.6 Hz，H-6)，7.66(1H，t J=7.6 Hz，H-7)，8.01(1H，d，J=8.5 Hz，H-8)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3))δ：164.1(C-8b)，157.0(C-4)，145.9(C-8a)，143.8(C-2)，129.9(C-7)，128.0(C-8)，124.0(C-6)，122.5(C-5)，119.0(C-3a)，105.0(C-3)，103.5(C-4a)，59.3(4-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致[11]，故鑒定化合物4為白鮮堿。

化合物5：白色針晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3) δ：7.68(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，7.40(1H，t，J=7.5 Hz，H-7)，7.62(1H，t，J=7.5 Hz，H-8)，7.98(1H，d，J=8.4 Hz，H-9)，4.05(s，3H，5-OMe)，3.90(1H，dd，J=6.5，5.0 Hz，H-3)，3.21(1H，dd，J=5.0，17.2 Hz，H-4β)，2.96(1H，dd，J=17.2，6.5 Hz，H-4α)，1.45(s，3H，2-Me)，1.47(s，3H，2-Me)13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：79.0(C-2)，68.5(C-3)，26.6(C-4)，108.5(C-4a)，160.8(C-5)，120.5(C-5a)，125.4(C-6)，123.8(C-7)，123.0(C-8)，121.0(C-9)，146.5(C-9a)，164.0(C-10a)，21.5(2-Me)，25.0(2-Me)，61.2(5-OMe)以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致[12]，故鑒定化合物5為4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline。

化合物6：淺黃色針晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.87(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.22(1H，m，H-6)，7.47(1H，m，H-7)，7.67(1H，d，J=8.5 Hz，H-8)，3.52(1H，dd，J=16.5，7.1 Hz，10α-H)，3.69(1H，dd，J=7.1，16.5 Hz，10β-H))，4.61(1H，t，J=7.1Hz，H-11)，4.16(3H，s，4-OMe)，1.28(3H，s，13-Me)，1.49(3H，s，14-Me)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：147.5(C-1)，168.7(C-2)，102.1(C-3)，159.0(C-4)，122.0(C-5)，123.5(C-6)，123.0(C-7)，127.1(C-8)，120.3(C-9)，29.3(C-10)，86.7(C-11)，71.6(C-12)，58.5(4-OMe)，24.7(13-Me)，26.2(14-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致[13]，故鑒定化合物6為R-(+)-Platydesmin。

化合物7：淺灰色針晶(MeOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6) δ：11.40(1H，s，N-H)，5.99(1H，s，H-3)，7.31(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，7.18(1H，t，J=7.7 Hz，H-6)，7.51(1H，t，J=7.7 Hz，H-7)，7.82(1H，d，J=8.5Hz，H-8)，3.95(3H，s，4-OMe)。13C-NMR(100 MHz， DMSO-d6) δ：164.0(C-2)，163.0(C-4)，138.9(C-8a)，131.2(C-7)，122.7(C-5)，122.0(C-6)，115.8(C-4a)，115.0(C-8)，96.8(C-3)，56.5(4-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致[14]，故鑒定化合物7為4-methoxy-2(1H)-quinolinone。

化合物8：淡黃色粒晶(MeOH)。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ：10.09(1H，s，7-OH)，7.89(1H，d，J=2.6 Hz，H-2)，δ7.36(1H，d，J=2.6 Hz，H-3)，4.37(3H，s，4-OMe)，8.02(1H，d，J=9.1Hz，H-5)，7.02(1H，dd，J=9.1，1.7 Hz，H-6)，7.09(1H，d，J=1.7Hz，H-8)；13C-NMR(100MHz，DMSO-d6) δ：143.0(C-2)，105.4(C-3)，101.5(C-3a)，158.5(C-4)，112.2(C-4a)，123.8(C-5)，116.6(C-6)，156.8(C-7)，109.0(C-8)，147.3(C-8a)，164.2(C-8b)，59.5(4-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致[15]，故鑒定化合物8為7-羥基白鮮堿。

3.2 抗腫瘤活性篩選

利用CCK-8法體外測(cè)試8個(gè)生物堿類(lèi)成分對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2、胃癌細(xì)胞BGC的抑制活性，以喜樹(shù)堿作為陽(yáng)性對(duì)照藥品，結(jié)果(表1)表明：R-(+)-Platydesmin、4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2具有較高的抑制活性，IC50值分別為26.4 μM、23.6 μM；對(duì)胃癌細(xì)胞BGC也具有較高的抑制活性，IC50值分別為21.8 μM、24.2 μM；白鮮堿、7-羥基白鮮堿對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2、胃癌細(xì)胞BGC均表現(xiàn)出了抑制活性，IC50值分別為42.3 μM、40.9 μM、48.6 μM、47.5 μM，其他生物堿對(duì)這兩種腫瘤細(xì)胞的抑制率不明顯。

表1 化合物1～8對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2和胃癌細(xì)胞BGC的抑制活性

3.3 抗腫瘤機(jī)制研究

與細(xì)胞周期有著密切關(guān)系的調(diào)控基因能否正常有序表達(dá)，決定著細(xì)胞周期能否正常運(yùn)轉(zhuǎn)，其調(diào)控與細(xì)胞周期蛋白(Cyc-lin)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子(CDKI)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶(CDK))也關(guān)系緊密，三者通常以CDK 為核心，Cyclin 對(duì)其具有正調(diào)控作用，CDKI 對(duì)其具有負(fù)調(diào)控作用。通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)R-(+)-platydesmin和4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline可能與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶(CDK)存在相互作用，見(jiàn)圖1、圖2，表明這兩個(gè)生物堿可能是通過(guò)抑制細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)、阻滯細(xì)胞周期來(lái)抑制肝癌細(xì)胞HepG-2、胃癌細(xì)胞BGC細(xì)胞的增殖。通過(guò)體外活性研究實(shí)驗(yàn)，證實(shí)這兩個(gè)生物堿對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2、胃癌細(xì)胞BGC均具有較高的抑制活性，說(shuō)明這兩個(gè)生物堿能夠抑制這兩種腫瘤細(xì)胞活性，誘導(dǎo)其凋亡，可能與阻滯細(xì)胞周期有關(guān)。其他6個(gè)生物堿分別與4個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接，結(jié)果均未能找到相互作用的跡象，體外活性實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了白鮮堿、7-羥基白鮮堿對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞抑制活性較差，其他4個(gè)生物堿未表變現(xiàn)出抑制活性。

圖1 R-(+)-platydesmin與CDK可能的分子間相互作用

圖2 4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2- dimethy pyrano(2，3-b) quinoline與CDK可能的分子間相互作用

4 結(jié)語(yǔ)

天然植物中的生物堿類(lèi)成分具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的活性，研究表明，其通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化與凋亡、抑制細(xì)胞端粒酶活性、抑制腫瘤細(xì)胞周期和增殖等多種途徑，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖[16]。本實(shí)驗(yàn)從三椏苦中初步分離得到8個(gè)生物堿類(lèi)成分，并利用肝癌細(xì)胞HepG-2、胃癌細(xì)胞BGC為對(duì)象進(jìn)行了體外抗腫瘤活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline、R-(+)-platydesmin對(duì)這兩個(gè)腫瘤細(xì)胞具有較高的抑制活性。通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)生物堿與腫瘤細(xì)胞中的CDK存在相互關(guān)系，證實(shí)了這兩種生物堿具有體外抑制腫瘤細(xì)胞活性，初步闡釋了其抗腫瘤活性機(jī)制。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中還有很多含有生物堿的流分還未被分離，課題組會(huì)進(jìn)一步分離生物堿類(lèi)成分，估計(jì)還會(huì)有其他生物堿被分離出來(lái)，同時(shí)會(huì)進(jìn)行體外抗腫瘤活性分析，可能還會(huì)發(fā)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞有較高活性的生物堿。這有利于闡明其有效成分，為擴(kuò)大三椏苦的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)、為醫(yī)藥企業(yè)對(duì)該藥材進(jìn)行深入開(kāi)發(fā)提供必要依據(jù)。