鄧 晨,周化嵐,梁營芳,王 鋒,張建國

(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院,上海 200093)

碳點(CDs)是一類零維熒光準球形納米顆粒,其尺寸小于10 nm[1],由XU 等[2]于2004年發(fā)現。他們通過電弧放電的方法合成單壁碳納米管(SWCNTs),然后對其懸浮液進行分離純化時,發(fā)現了一種新型熒光納米材料可以在波長365 nm 的紫外光下發(fā)出不同顏色的熒光,進而CDs的特性、合成方法和應用得到了廣泛的研究[3]。熒光CDs的關鍵特性包括激發(fā)光/酸度依賴性、化學穩(wěn)定性、抗光漂白性以及上轉換熒光[3]。與半導體量子點相比,CDs的低毒性和高生物相容性,使其在生物成像和化學生物傳感等方面成為半導體量子點的有力競爭者[4]。CDs熒光分析法具有高靈敏度、易操作、低成本和結果輸出快速等顯著優(yōu)勢,因此,其在食品安全領域具有巨大的應用潛力[5]。本工作重點介紹CDs的熒光性質、合成方法及其在食品分析中的應用,包括其在重金屬離子、病原體、農藥和獸藥殘留、食品添加劑、食品中營養(yǎng)成分等方面檢測中的最新進展。此外,還討論了CDs在基礎研究和應用方面目前面臨的挑戰(zhàn)和未來的展望。

1 CDs的熒光性質

1.1 熒光產生機理

熒光發(fā)射是CDs的重要光學特性,但是其熒光的產生機理仍然存有爭議。目前已經報道了幾種機理,包括量子尺寸效應[6-7]、表面缺陷狀態(tài)[8-9]、分子和類分子狀態(tài)[10-12]等。量子尺寸效應是指尺寸對電子-空穴對的輻射復合的影響,而表面缺陷狀態(tài)是指通過氧化形成的表面缺陷[13-14]。最近,分子和類分子狀態(tài)被證明是CDs熒光的來源,特別是檸檬酸衍生的CDs[12]。許多熒光性質,包括激發(fā)光依賴性和酸度依賴性,都可以用這些機制來解釋。

1.2 激發(fā)光/酸度依賴性

CDs的激發(fā)光依賴性可能是由于CDs表面的量子效應和/或不同的表面缺陷引起的[15]。ZHENG 等[16]認為與激發(fā)光有關的性質可能與芳香族C＝C及C－OH 和C＝O 等基團的表面缺陷有關。使用檸檬酸銨和乙二胺作為前體合成的CDs具有激發(fā)光依賴性。LI等[17]推斷CDs的表面缺陷和較窄的尺寸分布可能與其激發(fā)光相關的特性有關。還有一些報道中CDs顯示出與激發(fā)光無關的發(fā)射[18-19],這可能歸因于其均勻的尺寸和表面狀態(tài)。CDs的熒光性質也受酸度的影響[20],可能是CDs表面官能團的質子化和去質子化作用的結果[21-23]。近年來,熒光pH 納米傳感器已被廣泛地制備[24-25],且酸度在pH 3.5～10.0內與熒光強度呈良好的線性關系[22]。CDs激發(fā)光/酸度依賴性不僅在多色成像和pH 感測中起關鍵作用,而且還有助于其潛在的熒光機制發(fā)揮作用[26]。

1.3 化學穩(wěn)定性和抗光漂白性

在熒光檢測應用中,穩(wěn)定的熒光信號和較長的發(fā)射壽命是熒光傳感/成像的必要條件。一般而言,CDs可以在水和高鹽度溶液中保存較長時間并且維持穩(wěn)定。在一些研究中,CDs的熒光強度在6 個月[27]甚至1年[28]內基本沒有變化。LIU 等[29]制備的CDs在4 mol·L－1NaCl溶液和400μmol·L－1H2O2溶液中都很穩(wěn)定,很好地說明了CDs的抗氧化性。此外,CDs適用的酸度范圍較寬,為pH 3～12[30]。與CDs的化學穩(wěn)定性相比,其抗光漂白性更為重要,因為許多測定需要長時間的觀察。幸運的是,CDs通常表現出極好的抗光漂白性。例如,不同CDs在UV 照射12 h[31]和24 h[32]后,熒光強度僅略有下降。

1.4 上轉換熒光

上轉換熒光是一種發(fā)射波長小于激發(fā)波長的反斯托克斯發(fā)光現象[33]。大多數報道的CDs和生物組織在紫外光的激發(fā)下通常會發(fā)出藍色熒光,這顯然妨礙了對生物體進行熒光分析的準確度[34]。上轉換熒光特性為避免含有蛋白質或氨基酸的生物或食品基質的自發(fā)熒光提供了解決方法。此外,合成具有上轉換熒光發(fā)射的CDs非常簡單,不需要對傳統(tǒng)鑭系元素摻雜的上轉換熒光納米粒子進行復雜的修飾。

2 CDs的合成

CDs的合成方法大致可分為兩類[35]:①自上而下合成法;②自下而上合成法。自上而下合成法主要是通過化學、電化學或物理方法將碳前體分解為納米級材料的方法,例如電弧放電法、激光燒蝕法、電化學氧化法等。自下而上合成法通常使用小分子作為反應前體,再通過化學合成的方法合成CDs,包括水熱合成法、溶劑熱法、超聲波振蕩法和微波消解法。相比于自上而下合成法,自下而上合成法條件更容易控制且碳源豐富,合成的CDs通常具有較高的熒光量子產率(QY),應用更為廣泛?；诖?下面將主要介紹幾種自下而上合成法。

2.1 水熱合成法

在各種化學方法中,水熱合成法是一種極有前途的技術,通常是指在高壓和最佳溫度條件下,在水性溶劑或礦化劑的存在下,發(fā)生非均相化學反應,以溶解和重結晶在常規(guī)條件下合成相對不可溶的材料的方法[36]。此法合成的納米粒子具有形狀、大小、表面改性和穩(wěn)定性可控的性質。由于其眾多優(yōu)點,水熱合成技術已被許多研究小組廣泛用于合成CDs。YAN 等[37]用己二酸(碳源)和檸檬酸三銨(表面鈍化劑)進行一鍋水熱處理,合成了水溶性光致發(fā)光CDs。ZHANG 等[38]用L-抗壞血酸作為碳源,并對其進行水熱處理,一步合成了高穩(wěn)定、單分散的熒光CDs。該方法簡便易行,可用于大規(guī)模工業(yè)生產中CDs的合成和分離。

2.2 溶劑熱法

溶劑熱法是一種通過在有機溶劑中加熱有機分子來制備CDs的簡單方法。遵循“自下而上”的原則,通過前驅體的聚合和碳化很容易合成CDs[39-40]。實際上,許多有機分子都可通過溶劑熱處理來制備CDs[41-43]。例如,WU 等[44]通過維生素C 和乙二醇的溶劑熱處理合成了CDs;同時他們還利用四氯化碳(CCl4)和NaNH2成功地合成了CDs[45]。該方法操作簡單,但其應用會受到有機溶劑的毒性和較高反應溫度的限制。

2.3 超聲波振蕩法

2011年,LI等[46]在酸性或堿性環(huán)境下對葡萄糖進行超聲波處理,成功獲得了直徑小于5 nm、QY為7%的光致發(fā)光CDs。這種利用超聲波的高能,在酸、堿或氧化劑的存在下將碳材料裂解成納米粒子(NPs)的方法,被認為是合成CDs的新途徑。此合成過程利用高能超聲波,避免了復雜的后處理工藝,實現了小尺寸CDs的簡便合成。然而,此法需要對反應時間和QY 進行優(yōu)化。

2.4 微波消解法

在合成CDs的方法中,微波消解法以快速、高效、方便等優(yōu)點得到了廣泛的應用。早在2009年,ZHU 等[47]采用微波消解法在極短的反應時間內就在具有優(yōu)異光物理性質的碳水化合物中提取了CDs。LIU 等[48]通過微波消解法,用甘油和4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺作為表面鈍化劑合成了光致發(fā)光CDs,他們認為是由于在CDs表面上引入了氨基(NH2),使QY 達到了12%。在2017年,CHOI等[49]利用微波誘導的熱聚酰胺化和碳化作用,將賴氨酸(AB2型聚酰胺化單體,A:－COOH,B:－NH2)熱解,得到QY 為23.3%的水溶性CDs,合成可在5 min內完成。該研究表明,前體中的支化點是獲得高QY 的CDs的關鍵因素,為快速制備具有優(yōu)異性能的CDs提供了新的方向。

3 CDs在食品檢測中的應用

目前已有多種先進技術用于食品安全檢測,例如氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)、液相色譜-質譜法(LCMS)和酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)[50-53]。這些方法大多數都具有如樣品前處理復雜、檢測時間長等缺點,特別是要依賴昂貴的儀器和專業(yè)人員,這限制了它們在發(fā)展中國家,以及設施和專家條件較差的地區(qū)的應用。綠色合成的CDs熒光強度高、穩(wěn)定性和抗光漂白性良好,在熒光傳感分析中具有顯著優(yōu)勢。利用不同的碳源,結合不同的合成方法,可以控制合成不同性質的CDs。CDs作為一種熒光傳感探針,在食品分析檢測中有著非常廣闊的應用前景。下面將簡述CDs在重金屬離子、食品添加劑、農藥和獸藥殘留、食品中營養(yǎng)物質、病原體等方面的檢測應用,旨在為CDs在食品分析領域的進一步研究提供參考。

3.1 重金屬離子檢測

一些常見的金屬離子如Al3＋、Hg2＋、Cu2＋、Fe3＋等是不可生物降解的,它們通過食物鏈在人體內積累,會引起各種健康問題。因此,金屬離子檢測是食品安全監(jiān)測中必不可少的一環(huán),尤其是有毒重金屬離子檢測。CDs與金屬離子相互作用會導致熒光猝滅,因此常被制作為傳感器用于快速、靈敏地檢測金屬離子。

YANG 等[54]在100 ℃且存在H2O2的條件下將蜂蜜在水中加熱2 h合成了CDs,紅外光譜顯示其表面存在O－H、N－H、C＝N、C＝O、C＝C 和C－O等基團。熒光的最大激發(fā)和發(fā)射波長被確定為338,420 nm,它們的熒光強度依賴于酸度。合成的CDs在Fe3＋存在下會發(fā)生聚集,熒光強度下降。該傳感器用于檢測Fe3＋,檢出限為1.7 nmol·L－1。體系中其他共存離子,包括Hg2＋、Fe2＋、Pb2＋、Ag＋、Ca2＋、Co2＋、Mn2＋、Sr2＋、Zn2＋、K＋、Na＋、Cu2＋,對于Fe3＋的檢測無干擾。ZHU 等[55]通過熱碳化海帶汁的水合成了聚乙烯亞胺(PEI)修飾的CDs,并將其用于酸奶樣品中Cu2＋的雙信號熒光檢測。

Hg2＋對于羧基有很強的親和力?；诖?HOU 等[56]提出了一種簡單且經濟的方法,通過檸檬酸鈉和尿素的電化學碳化制備了具有良好水溶性的功能化熒光CDs。將QY 為11.9%、平均尺寸為2.4 nm 的CDs作為無標簽傳感探針選擇性檢測Hg2＋,檢出限低至3.3 nmol·L－1。此外,CDs易于功能化的表面促進了具有特定功能的熒光傳感器件的研究和開發(fā),擴展了其在檢測領域的實際應用。在痕量重金屬離子分析中,基于CDs的傳感探針由于其高精度和可靠性逐漸成為有價值的傳感器件。

3.2 食品添加劑檢測

在食品工業(yè)中,食品添加劑對保證食品的色香味、提高食品質量起著重要的作用。然而,合法添加劑(包括著色劑、混凝劑、防腐劑等)的過度使用以及違禁添加劑(包括蘇丹紅Ⅰ、三聚氰胺、瘦肉精等)的添加,造成了新的食品安全問題,對人類健康構成嚴重威脅。

3.2.1 合法添加劑

LIN 等[57]以甘油為碳源,PEG 1500為鈍化劑,微波輔助合成絲氨酸修飾的CDs。在亞硝酸鹽和酸化的H2O2溶液存在下建立了一種亞硝酸鹽的定量檢測方法。在1.0×10－7～1.0×10－5mol·L－1內,熒光強度隨亞硝酸鹽濃度增加呈線性增加。在此基礎上,該方法成功應用于純牛奶中亞硝酸鹽的檢測。YUAN 等[58]采用N-β-羥基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)為碳源合成CDs。合成的CDs能發(fā)出強烈的藍色熒光,而食用色素日落黃能通過熒光共振能量轉移選擇性猝滅該藍色熒光,由此開發(fā)了一種基于CDs的納米傳感器用于檢測日落黃,線性范圍為0.3～8.0μmol·L－1,檢出限為79.6 nmol·L－1。XU 等[59]利用新鮮蘆薈作為前體合成CDs,發(fā)現檸檬黃可以通過靜態(tài)猝滅過程有效地猝滅CDs的熒光。利用這種猝滅現象,研制了檢測檸檬黃的熒光探針,線性范圍為0.25～32.5μmol·L－1,檢出限為73 nmol·L－1。該探針可用于饅頭、蜂蜜、糖果等食品樣品中痕量檸檬黃的檢測。

3.2.2 違禁添加劑

三聚氰胺是氰胺的三聚體,常用于阻燃產品、紡織工業(yè)和殺蟲劑的生產。由于其成本低、含氮量高,三聚氰胺常被非法摻入牛奶、嬰兒配方奶粉和寵物食品中。攝入超過安全限值的三聚氰胺(美國和歐盟的嬰兒配方奶粉限值為2.5 mg·kg－1,中國為1.0 mg·kg－1)會導致嬰兒腎衰竭甚至死亡。HU等[60]設計了一種Au＠CDs納米復合材料,可以與智能手機相結合,直觀地分析牛奶中的三聚氰胺。該檢測方法的檢出限較低,為3.6 nmol·L－1,線性范圍為1～10 mol·L－1,回收率為102.75%～105.64%。在這種檢測系統(tǒng)中,熒光光譜與便攜設備的結合,實現了快速、簡單、直觀的檢測,為智能檢測的發(fā)展提供了新的方向。

蘇丹紅Ⅰ是一種致癌物,由于其誘人的紅色和低成本而被廣泛用作食品添加劑,尤其是在辣椒粉中。SU 等[61]以香煙過濾嘴為碳源,通過簡單、低成本、綠色的水熱合成法成功地合成了QY 為14%的CDs。HU 等[62]以再利用廢橡膠輪胎作為低成本碳源合成高價值的熒光CDs,在水熱條件下,利用過硫酸銨氧化輪胎并提供氮原子供摻雜,得到QY 高達23.8%的CDs。他們都是利用蘇丹紅Ⅰ猝滅CDs熒光的原理實現對蘇丹紅Ⅰ的快速、靈敏檢測。YANG 等[63]為了實現對番茄醬中的蘇丹紅Ⅰ的檢測,成功制備了硫摻雜的CDs,且在pH 5.0以內具有良好的穩(wěn)定性。該傳感器檢測蘇丹紅Ⅰ的線性范圍為40μmol·L－1以內,檢出限為0.12μmol·L－1。

3.3 農藥和獸藥殘留檢測

食物中殘留的農藥和獸藥,包括在食物中積累的藥物原型及其代謝物,都對人類健康有潛在的危害[64]。對這些殘留物的有效分析是食品安全研究中的一個重要課題。新興的CDs材料可以提供更準確、高效、經濟的熒光傳感材料,近年來,其在食品中農藥和獸藥殘留檢測方面取得了很大進展。

具有特異識別功能的分子印跡聚合物(MIPs)常用于復雜基質的純化和食品中農藥、獸藥微量靶分子的富集分離。新興的嵌入CDs的MIPs為檢測食品中的小分子有害物質提供了非常有意義的思路。ZHANG 等[65]設計了一種含有MIPs的室溫離子液體(RTIL)敏化的CDs傳感探針(RTIL-SCDs-MIPs),用于檢測蔬菜和茶葉樣品中的殺蟲劑氯氟菊酯,檢出限為0.5μg·kg－1。CHANG 等[66]利用碳基納米顆粒作為傳感受體開發(fā)了一種用于檢測對氧磷的單鏡頭光學生物傳感器,結果發(fā)現:CDs的強黃色熒光猝滅程度與對氧磷的濃度有關;檢出限為(0.22±0.02)μmol·L－1。FU 等[67]構建了一種基于CDs和Fe3＋的復合熒光傳感器,該傳感器對礦泉水、牛奶和豬肉樣品中的氨芐西林有良好的響應,檢出限為0.7μmol·L－1。此研究的優(yōu)點是CDs表面官能團還可為Fe3＋提供結合位點,為該傳感器在多個目標物的檢測中的應用提供了更可行且有前景的方法。與基于核殼聚吡咯-Cd TeQDs-MIP 的納米光學傳感器[68]相比,基于CDs/Fe3＋的傳感器不需要復雜的合成過程和較長的反應時間。重要的是,使用CDs可減少基于重金屬的QDs在實際應用中的潛在毒性。

隨著熒光免疫傳感器的發(fā)展,CDs有望成為一種替代性的綠色熒光試劑[69],它的出現為實現經濟、方便的免疫分析提供了新的思路。MIAO 等[70]報道了帶有藍色熒光的CDs的合成及其作為傳感探針在3種四環(huán)素類抗生素視覺識別和定量檢測中的應用。在這項研究中,四環(huán)素(TC)、土霉素(OTC)和氯四環(huán)素(CTC)的檢出限分別為5.18,6.06,14.00 nmol·L－1,均低于之前報道[71]中的結果?；贑Ds的檢測條帶上3種四環(huán)素類抗生素靶標的熒光信號差異明顯,可直觀區(qū)分,因此可以同時靈敏地檢測一個樣品中的多個目標物。

3.4 營養(yǎng)成分檢測

食品中營養(yǎng)成分可以為人體提供足夠的能量和營養(yǎng),如蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質等,都是正常生命活動所必需的。因此,檢測食品中的營養(yǎng)成分是非常必要的。在食品分析領域,CDs已作為傳感探針用于檢測和分析食物的功能成分,如蛋白質、維生素、酚類化合物等,這是因為其不僅具有良好的光學性質,還具有顯著的環(huán)保優(yōu)勢、價格低、方便和快速等特點。

谷胱甘肽(GSH)作為氧化還原緩沖液,可以維持生物體內的細胞氧化還原平衡,廣泛存在于動物、植物和微生物中[72]。XU 等[73]通過“開啟”策略開發(fā)了一種熒光探針,用于檢測食品中的GSH。他們將檸檬酸鈉與尿素混合,水熱合成法制備CDs,并通過Hg2＋電子轉移對CDs 的熒光進行猝滅。在GSH 存在下,熒光傳感器切換到“開”狀態(tài),這是由于GSH 與CDs的官能團競爭性結合Hg2＋所致。該熒光傳感器成功地應用于各種食品樣品中GSH的測定,回收率高,檢出限為37 nmol·L－1。此外,還有報道用毒性較低的Cu2＋替代Hg2＋,從而實現對食品中GSH 的高效檢測[74]。

卵清蛋白(OVA)含量被作為評價蛋白質質量的參考。FU 等[75]通過一步水熱合成法合成了一種新型的N、O、P 共摻雜CDs(NOP-CDs),并應用于雞蛋制品中OVA 的定量檢測。在由NOP-CDs、氧化石墨烯和OVA 抗體組成的熒光共振能量轉移系統(tǒng)中,“開-關”傳感探針基于抗原-抗體的特異性相互作用,實現了對OVA 的選擇性識別和捕獲,檢出限為153μg·L－1。PURBIA 等[76]開發(fā)了綠色和藍色熒光的高發(fā)光效率CDs(尺寸:1～6 nm),用于檢測維生素B1,檢出限為280 nmol·L－1。該熒光傳感器的原理是CDs的熒光可以被Cu2＋猝滅,在加入硫胺素后由于形成可溶性的銅-硫胺素絡合物而重新恢復,從而實現對目標成分的快速檢測。

植物源性食品中的某些小分子物質具有特殊的抗菌、消炎或抗氧化特性,從而使食品具有特殊的藥用特性。這些小分子被定義為“功能成分”,這種食品被稱為“藥食同源食品”[77-78]。對藥食同源食品中功能成分的定性或定量分析是評價其質量的主要方法。熒光CDs為這類功效成分的分析檢測提供了一種有效、方便、準確的方法。YANG 等[79]通過蘋果酸和尿素水熱處理合成了水溶性CDs(直徑為2.1 nm,QY 為16.5%),用于金銀花中綠原酸的熒光檢測。當綠原酸濃度在0.15～60 mol·L－1內增加時,CDs 的熒光可被有效猝滅,檢出限為45 nmol·L－1。與使用HPLC 和HPLC-串聯(lián)質譜法(MS/MS)檢測綠原酸的結果進行比較[80-81],所開發(fā)的基于CDs的檢測方法不僅靈敏度有提升,而且檢測速率明顯提高,適用于大量金銀花樣品的快速篩選。

3.5 病原體檢測

近年來,由食源性疾病引起的食品安全事故在世界各地屢屢發(fā)生。常見的食源性病原體有沙門氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌等,是引起食源性疾病的主要原因[82-83]。

WENG 等[84]使用一步加熱法以固體檸檬酸銨和甘露糖(Man)合成了Man修飾的熒光CDs(Man-CDs),并將其成功地應用于大腸桿菌的標記。甘露糖與大腸桿菌凝集素的選擇性結合使Man-CDs與大腸桿菌特異性結合,實現了對實際樣本(自來水、蘋果汁)中低濃度水平(103 CFU/m L)的大腸桿菌的定量檢測。需要注意的是,病原體的適當配體是構建用于檢測食源性病原體的基于CDs探針的關鍵組件之一。有效的配體應能夠與CDs緊密結合,同時確保與靶標結合時CDs的化學和光學性質的穩(wěn)定性。阿米卡星是一種眾所周知的氨基糖苷類抗生素,可用作大腸桿菌的結合配體。CHANDRA等[85]報道了一步法合成阿米卡星修飾的CDs(CDs-阿米卡星)用于大腸桿菌的測定。該方法的線性范圍為7.625×102～3.904×105CFU/m L,檢出限為522 CFU/m L。此外,它已成功應用于各種果汁樣品(蘋果汁、菠蘿汁和橙汁)中的大腸桿菌檢測。WANG 等[86]構建了CDs-適配體絡合物(CDs-apt),用于蛋殼溶液和自來水中鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測,且不受大腸桿菌O157:H7和金黃色葡萄球菌的干擾,檢測范圍為1.0×103～1.0×105CFU/m L,檢出限為50 CFU/m L。

4 結論與展望

CDs作為一種新型的碳基納米材料,具有優(yōu)良的熒光性、良好的生物相容性、低毒性和較低的制造成本等特點,引起了越來越多研究人員的興趣,并成為研究熱點。相關文獻已從合成、功能化到應用等方面對CDs進行了深入研究,并取得了一定的進展。然而,CDs的發(fā)展及其應用,特別是在食品分析方面,仍處于初步研究階段,有以下問題有待解決:①雖然目前CDs的類型趨于多樣化,但與半導體量子點相比,各CDs的熒光QY 仍較低,其發(fā)光或熒光機理的解釋仍需深入研究;②食物基質的復雜性在一定程度上限制了基于CDs的檢測的特異性和敏感性;現有的方法大多是針對單一目標物的,對于同一樣本中同時檢測多個目標物的研究較少。因此,通過選擇合適的碳源和優(yōu)化合成工藝,若能提高CDs的QY、化學穩(wěn)定性和再現性,將為CDs的產業(yè)化做出巨大貢獻。此外,摻雜或表面功能化CDs結合免疫分析、電化學傳感器、MIPs等方法,將進一步拓寬應用范圍,提高方法的靈敏度、準確度和特異性。隨著免疫分析方法和傳感器技術在食品安全領域的不斷發(fā)展和應用,CDs與免疫分析方法和傳感器技術的結合有望為食品安全監(jiān)管提供一個有前景的平臺。