王夢妍，婁加陶(上海胸科醫(yī)院，上海交通大學附屬胸科醫(yī)院檢驗科，上海 200030)

腫瘤轉(zhuǎn)移是影響患者預后最直接的危險因素[1]。傳統(tǒng)的腫瘤轉(zhuǎn)移檢測金標準——組織活檢作為一種侵入性的檢查手段，對于年齡較大、病情較重的患者適用性差。而目前臨床應用的許多影像學方法也存在不同程度的缺陷，如18F-NaF(一種帶有藥代動力學性能的PET成像的示蹤劑)結(jié)合正電子發(fā)射計算機斷層顯像(positron emission tomography PET)/電子計算機斷層掃描(computed tomograhy,CT)對監(jiān)測腫瘤骨轉(zhuǎn)移非常敏感，但18F-NaF會極大地影響患者的治療效果[2]。PET試劑——氟化葡萄糖也常用于轉(zhuǎn)移性前列腺癌，且具有較高的預后價值，但其主要用于晚期且很難評估其是否具有足夠的敏感性。近年來，液體活檢作為一種新型的診斷手段逐漸受到關注，其可以通過多種體液對腫瘤的轉(zhuǎn)移進行非侵入性實時監(jiān)測[3]。本文著重介紹不同液體活檢指標在腫瘤轉(zhuǎn)移中的應用進展及檢測方法。

1 液體活檢技術

“液體活檢”的概念最早于2010年提出，由循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumer cells，CTCs)作為乳腺癌活檢的替代療法，用于乳腺癌預后和治療反應評估。腫瘤的液體活檢是指以最小侵入性或非侵入性的方法取得患者的血液或其他液體樣本(尿液、腹水、唾液、胸腔積液等)，對其中的腫瘤細胞或核酸等生物學標志物，如CTCs、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumer DNA,ctDNA)、循環(huán)腫瘤微小RNA(miRNA)、外泌體(exosome)、血小板(platlets)等[4]進行檢測并獲取相關疾病信息的技術。相比于組織活檢這一腫瘤診斷傳統(tǒng)金標準，液體活檢具有很多優(yōu)勢，如非侵入性采樣、均質(zhì)化腫瘤異質(zhì)性、操作方便、耗時短、重復性高、可實時監(jiān)測腫瘤進展等。隨著精準醫(yī)學在腫瘤領域中的不斷發(fā)展，液體活檢的無創(chuàng)診療優(yōu)勢越來越受醫(yī)療業(yè)界關注，其臨床應用擴展到腫瘤的診斷、治療、轉(zhuǎn)移判斷等各個領域。

2 與腫瘤轉(zhuǎn)移相關的液體活檢標志物

2.1CTCs

2.1.1CTCs簡介 在活檢易引起高轉(zhuǎn)移性風險的腫瘤患者中，CTCs檢測有其優(yōu)勢，可用于判斷腫瘤對靶向治療的反應，如監(jiān)測腫瘤表面的抗PD-1配體1(PD-L1)蛋白[5]。另外，通過對CTCs進行基因分析，尤其是轉(zhuǎn)錄組學分析，對于轉(zhuǎn)移過程的研究非常重要。如采用RNA測序可檢測胰腺癌鼠模型中非經(jīng)典Wnt通路(尤其是Wnt2)中的腫瘤轉(zhuǎn)移關鍵信號[6]。在CTCs的DNA甲基化分析中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CTCs具備一些與腫瘤-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相似的甲基化改變，如轉(zhuǎn)移性去勢性前列腺癌的CTCs中出現(xiàn)了EMT相關基因miR-200c/141和miR-200b/a/429 CpG島甲基化水平顯著升高(分別為33.7%和37.1%)，而轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者CTCs中，EMT相關基因miR-200c/141、miR-200b/a/429和CDH1 CpG島甲基化水平分別升高了7.2%、20.8%和1.1%[7]。目前，CTCs多用于跟蹤監(jiān)測不同的突變型，特定的CTCs亞群還能決定腫瘤轉(zhuǎn)移的器官傾向性[8]。同時，CTCs還能用于功能性研究，包括CTCs的產(chǎn)生、存活、與血液組分的相互作用以及CTCs進入血流后產(chǎn)生的遠處損傷。因此，CTCs可為轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的溯源提供有價值的信息。

2.1.2CTCs檢測技術 目前已經(jīng)有40多種方法用于分離CTCs，主要包括基于CTC生物學特性和基于其物理特性的分離方法兩大類?；谏飳W特性的方法包括生物標志物檢測[如CELLSEARCH?circulating tumor cell (CTC) test]和生物標志物與微流控技術相結(jié)合(如Isoflux?FICOLL and EpCAM-based microfluidic device)?；谖锢硖匦缘姆椒òǜ鶕?jù)CTC的大小、密度、離心力、導電性、變形性和光流控特性對CTC進行分離。其中強生公司的CELLSEARCH?circulating tumor cell (CTC) test(7900001)檢測試劑盒是目前唯一被美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)授權的CTC檢測技術，已經(jīng)應用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌的臨床診斷，該項技術通過抗體包被的磁珠識別腫瘤細胞表面的特異性蛋白，然后通過磁鐵吸附磁珠達到分離CTCs的目的。此外，還有CTCs芯片以及用納米毛刷上的抗體捕獲等新型CTCs分離技術[9]。但富集CTCs的過程中很難保持其完整性，如流式細胞技術會破壞細胞團等，盡管已有分離CTCs細胞團的相關研究[10]，但在技術層面還不夠完善。由于分離難度大，CTCs技術的臨床應用仍然會受到許多限制，如尚未形成標準化的單個和成團的細胞富集技術，目前用于分離分析CTCs中DNA的技術不夠靈敏，有的CTCs不表達上皮細胞黏附分子(EpCAM)，所以不能被以EpCAM為基礎的方法捕獲等[11]。綜上，檢測CTCs的技術仍處于發(fā)展階段，這也是限制其應用的主要制約因素。

2.2ctDNA

2.2.1ctDNA簡介 研究表明，腫瘤發(fā)生時，其DNA片段會持續(xù)匯入血流[12]。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力主要來源于其形成早期，初級腫瘤細胞獲得的突變等位基因不僅使細胞有了選擇性復制的優(yōu)勢，還包括是否存在轉(zhuǎn)移傾向。相比于后期腫瘤的遺傳學改變，轉(zhuǎn)移能力受最初腫瘤發(fā)生突變的等位基因的特性影響更大。

血流中多種與癌癥相關的DNA片段長度均低于正常組織來源的DNA片段，且血液中可檢出的高濃度短鏈DNA片段與腫瘤轉(zhuǎn)移具有一定相關性，如黑色素瘤患者出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移時，83%的患者血液中ctDNA濃度升高[13]。

2.2.2ctDNA檢測技術 ctDNA檢測是目前非侵入性腫瘤基因分型最簡便的方法，它使更方便快捷的腫瘤基因分型技術的研發(fā)成為可能[14]。目前基于擴增阻滯突變系統(tǒng)(amplificaiton refractory mutation system, ARMS)的PCR技術在臨床上的應用較為廣泛，其操作簡便，成本較低，常用于檢測復發(fā)的熱點突變和單核苷酸多態(tài)性。例如通過ARMS PCR檢測BRAF突變基因，可監(jiān)測甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[15]。但ARMS PCR技術每次僅能檢測1個基因位點，且敏感性不高，僅約為0.1%～1%,限制了ARMS PCR的廣泛應用。相比于ARMS PCR，數(shù)字PCR(dPCR)技術敏感性較高，能使血液中DNA檢測的靈敏度精確至0.1%。Chang等[13]證實，使用微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)技術檢測ctDNA，可實現(xiàn)監(jiān)測轉(zhuǎn)移性黑色素細胞瘤的治療效果。此外，另有研究證實，幾種高度敏感的PCR技術，如BEAMing技術(數(shù)字PCR-流式技術)或PAP(焦磷酸激活的聚合作用)等均可檢出單個ctDNA分子[16]。隨著操作簡化和費用降低，dPCR技術，尤其是ddPCR，有望得到更廣泛的應用[17]。但dPCR的缺點是，所要尋找的異常基因的序列必須是已知的，而且是能同時檢測的突變。更為精準的全基因組測序(whole genome squencing, WGS)技術的應用使ctDNA相關的液體活檢得到發(fā)展，ctDNA得以從正常DNA中分離出來[18]。因此，無需提前假設突變基因的測序技術在臨床應用中更受青睞[19]。ctDNA的等位基因突變比例較低，故而非常適用于靶向NGS(Targeted NGS),如基于雜交捕獲的NGS和基于PCR的NGS等，目前已有通過NGS檢測骨肉瘤進展和轉(zhuǎn)移的研究[20]。但由于WGS費用較高，耗時較長，目前還不適用于常規(guī)的臨床檢測。

盡管以ctDNA為基礎的液體活檢在臨床上已經(jīng)得到了一定程度的應用，然而目前可用于腫瘤轉(zhuǎn)移診斷的方法仍然十分有限。因此，ctDNA檢測的推廣仍需要進一步降低成本、簡化實驗操作并提高檢測靈敏度。

2.3循環(huán)腫瘤miRNA

2.3.1miRNA簡介 miRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移的多個過程中起到調(diào)節(jié)作用，如EMT、侵襲、血管生成和遠處器官轉(zhuǎn)移等[21]。研究表明，分泌型miRNA，尤其是外泌體中的miRNA，與腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關。如腦星形膠質(zhì)細胞可以釋放富含miR-19a的外泌體，使乳腺癌細胞中的抑癌基因PTEN沉默，從而促進其遷移[22]。

2.3.2miRNA檢測技術 目前miRNA檢測方法主要包括高通量基因芯片、RNA測序、PCR檢測等，PCR檢測又包括莖環(huán)法、poly(A)尾法和ddPCR法。由于miRNA的序列較短而且含量低，擴增困難，因此，用基因芯片檢測miRNA的敏感性和特異性相對較低，一些miRNA序列僅有幾個堿基有差異，這就容易導致假陽性升高。目前主要通過核苷酸類似物的引入解決這類問題。如用寡核苷酸提高捕獲探針的熔解溫度進而提高其檢測靈敏度等。相比之下，RNA測序準確性較高，可以發(fā)現(xiàn)新的miRNA，即使檢測樣本中僅有小部分存在突變，也可以通過超深測序檢測出來。但是miRNA測序的數(shù)據(jù)解釋和分析較為復雜，費用較高，不同平臺的檢測結(jié)果也有較大差異。因此，可以參考基因組測序的方法，開發(fā)用于miRNA結(jié)果判讀的軟件，如miRDeep2等。PCR法中的莖環(huán)法和加尾法都是通過增加miRNA片段的長度提高檢測靈敏度，這也是目前應用最廣泛的檢測方法。但由于這兩種方法依然是相對定量的方法，目前又缺乏公認的內(nèi)參基因，因此這些缺陷不利于其普及。dPCR是絕對定量的方法，不需要參考基因，即使檢測低豐度樣本也有較高的靈敏性,而且對PCR抑制劑的耐受性高。但這種方法成本較高，操作繁瑣，機械化水平尚有待提高。

2.4外泌體

2.4.1外泌體簡介 外泌體是含有功能性生物分子(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA/RNA)的囊泡，可轉(zhuǎn)運入受體細胞。研究表明，外泌體的某些成分，如蛋白質(zhì)和miRNA，與腫瘤轉(zhuǎn)移存在高度相關性。例如在胰腺癌患者中，含有磷脂酰肌醇聚糖-1(GPC-1)的外泌體濃度與腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關，預示著外泌體可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移早期檢測的生物學標志物[23]。外泌體蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)生時的整合素譜具有獨特的表達特點。如外泌體蛋白組的變化能判斷黑色素瘤患者發(fā)生非特異性遠處轉(zhuǎn)移的風險[24]；外泌體整合素α6β4和α6β1與肺轉(zhuǎn)移有關，而αvβ5與肝轉(zhuǎn)移有關。分別以α6β4和αvβ5為靶點，能降低外泌體的攝取，并分別降低肺轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率[25]。

2.4.2外泌體檢測技術 目前已經(jīng)有可以通過外泌體檢測腫瘤的商品化試劑，主要包括離心柱法和超速離心法兩大類。離心柱法操作簡單，但很多商品化試劑盒中的外泌體吸附材料的特異性不高，因此，收集的外泌體常包含直徑更大的細胞外囊泡。而超速離心法分離的外泌體具有更高的純度，因此，其應用更為廣泛，但它需要能實現(xiàn)超高轉(zhuǎn)速的離心設備。目前已有基于以上2種方法的改進技術，如府偉靈教授團隊研發(fā)了基于捕獲外泌體標志物CD63的抽提方法，其通過對臨床樣本進行檢測，具有較好的應用潛能[26]。但由于外泌體之間CD63的表達水平存在差異，這種方法仍具有一定局限性。

2.5腫瘤血小板(TEP)

2.5.1TEP簡介 1877年，Kanikarla-Marie等[27]發(fā)現(xiàn)了“富含特異性腫瘤成分的血栓”參與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，隨后其對巨核細胞、血小板、癌癥之間相互作用的研究引出了TEP的概念。同時，血小板也有一定的吞噬攝取功能，例如，血小板能夠攝取腫瘤來源的細胞因子和RNA，促進原位腫瘤的血管形成。

在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程中，CTCs普遍被血小板包被，血小板能與CTCs相互作用，使CTCs定植于血管壁，同時，黏附在CTCs上的血小板能抑制免疫系統(tǒng)對CTCs的識別，從而引起CTCs轉(zhuǎn)移潛能增加[28]。另外，血小板引起的轉(zhuǎn)移風險升高還可能與TGF-β和組織特異性有關[29]。

2.5.2TEP檢測技術 目前對于TEP的檢測，主要集中于計數(shù)、大小、相關標志物和RNA。研究表明，血小板計數(shù)和大小與癌癥具有高度相關性，如血小板體積增大的胰腺癌患者生存率降低(P=0.000 5)[30]；同時，在多種癌癥中，高血小板計數(shù)均與高死亡率相關，如惡性間皮瘤、婦產(chǎn)科腫瘤、肺癌、腎癌、胃癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等。有學者指出，TEP中的LncRNAs和EGFRvIII有助于轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌的診斷[31]。TEP相關的標志物和RNA檢測主要通過基因芯片和RNA測序。但目前的技術很難發(fā)現(xiàn)某種亞群的血小板對腫瘤更為敏感，因此，仍需要更深入的探索。

3 小結(jié)與展望

近年來，微轉(zhuǎn)移細胞的研究和新一代測序技術發(fā)展迅猛，人們對于CTCs、miRNA、ctDNA等腫瘤相關生物學標志物的理解也日益加深。各種檢測方法為檢測腫瘤的生物學特性以及發(fā)生、發(fā)展過程提供了新的研究角度。液體活檢的優(yōu)勢是方便、快捷、減少患者痛苦并能使臨床醫(yī)師密切監(jiān)測患者對治療的反應和及早發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。從長遠來看，液體活檢可在患者出現(xiàn)癥狀之前，或在腫瘤轉(zhuǎn)移早期發(fā)現(xiàn)播散的腫瘤細胞，在血流中循環(huán)的腫瘤DNA所包含的遺傳信息可即時反映腫瘤發(fā)展的狀況，甚至可以以此探索腫瘤來源。近年來，對液體活檢的研究日益增多。為使液體活檢在檢測腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)中發(fā)揮充分的作用，在臨床應用中真正取代手術活檢，還需要進一步探索提高其敏感性和精密度、降低成本的方法。