溫偉球，郭建維

（廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州510006）

化學(xué)藥物治療法(化療法)是一種通過化學(xué)藥物干擾細胞分裂、代謝等機制從而抑制癌細胞快速增殖的治療方法，其作為一種全身性的治療手段，不僅對早期癌癥具有顯著的癌細胞抑制增長作用，而且對晚期轉(zhuǎn)移性腫瘤也有不錯的治療效果[1]。然而，化療法存在著抗癌藥物溶解性差、毒副作用大、無靶向選擇性、藥代動力學(xué)過程不可控制等缺點，影響其在臨床上癌癥的治療效果[2-3]。

為了提高化療法的治療效果，降低抗癌藥物的毒副作用，刺激響應(yīng)型聚合物膠束受到越來越多科研人員的關(guān)注，如pH響應(yīng)型[4-6]、溫度響應(yīng)型[7-8]和還原響應(yīng)型[9-10]等。其中，pH響應(yīng)型聚合物膠束可根據(jù)人體正常組織(pH=7.4)和腫瘤組織(pH=5.0)微環(huán)境pH值的差異，實現(xiàn)對抗癌藥物的可控釋放，具有巨大的應(yīng)用前景[11]。通過引入聚堿可構(gòu)筑pH響應(yīng)型聚合物膠束，在中性和酸性條件下聚堿發(fā)生負電荷(疏水性)到正電荷(親水性)的轉(zhuǎn)變，可有效控制釋放抗癌藥物[12-14]。通過酸不穩(wěn)定性化學(xué)鍵連接疏水和親水嵌段，也可制備pH響應(yīng)型聚合物膠束用于疏水性抗癌藥物的遞送，在中性條件下，載藥膠束可保持穩(wěn)定，而在酸性環(huán)境下，酸不穩(wěn)定性化學(xué)鍵斷裂導(dǎo)致聚合物膠束裂解，從而達到藥物控制釋放的目的[4,15]。

然而，pH響應(yīng)型聚合物膠束的研究和發(fā)展依然存在幾大亟待解決的問題，如聚合物膠束在人體血液循環(huán)中穩(wěn)定性不足，對抗癌藥物的包裹能力較低以及載藥膠束在腫瘤組織中積累效率低等[4,9]。在前期的研究中，多臂星狀聚合物納米載藥膠束顯示出良好的應(yīng)用性能，尤其是以剛性、大體積結(jié)構(gòu)單元為核構(gòu)筑的星狀聚合物膠束，具有較高的穩(wěn)定性和載藥能力，例如金剛烷基聚合物膠束的臨界膠束濃度(CMC=0.005 0 mg/mL)和載藥量(LC=10.39%)均優(yōu)于季戊四醇基聚合物膠束(CMC=0.008 7 mg/mL、LC=8.9 4%)[10]。

為了進一步提高p H響應(yīng)型聚合物膠束的穩(wěn)定性和載藥量，本文基于金剛烷基合成了四臂星狀pH響應(yīng)型聚合物金剛烷-[聚(乳酸-共-羥基乙酸)-聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯-聚(乙二醇)單甲醚]4(4sAd-PLGA-D-P)，并制備其自組裝膠束用于抗癌藥物的可控遞送。分別選用具有良好生物相容性的聚(乳酸-共-羥基乙酸)(PLGA)和聚(乙二醇)單甲醚(mPEG)作為聚合物的疏水嵌段和親水嵌段[16]。由于聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(PDEAEMA)具有良好的pH響應(yīng)性能，根據(jù)環(huán)境中pH值從中性降低至酸性可發(fā)生疏水性到親水性的轉(zhuǎn)變，對疏水性藥物可進行響應(yīng)性釋放[17]。通過改變聚合物中pH響應(yīng)單元PDEAEMA的鏈段長度，探究其對聚合物膠束性能的影響規(guī)律。

1 實驗部分

1.1 原料與試劑

D,L-丙交酯(ω=98%)、乙交酯(ω=98%)、溴化亞銅(ω=99%)：分析純，Sigma-Aldrich公司；2-溴異丁酰溴(ω=98%)、DEAEMA(ω=99%)、鹽酸阿霉素(DOX·HCl，ω=98%)、4-二甲基氨基吡啶(ω=99%)：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；炔基化聚乙二醇單甲醚(Mn=2 000)：分析純，上海愛純生物科技有限公司；1,3,5,7-四羥基金剛烷由實驗室自制[5]。

1.2 兩親性聚合物的合成

以1,3,5,7-四羥基金剛烷為引發(fā)劑，分別以PLGA、PDEAEMA及mPEG為疏水鏈段、pH響應(yīng)鏈段及親水鏈段，結(jié)合開環(huán)聚合反應(yīng)、原子轉(zhuǎn)移自由基反應(yīng)以及點擊化學(xué)中的銅(I)催化疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)(CuAAC)合成聚合物4sAd-PLGA-D-P，其具體合成路線和方案如圖1所示。

圖1 聚合物4sAd-PLGA-D-P的合成路線Fig.1 Synthetic route of 4sAd-PLGA-D-P

將1,3,5,7-四羥基金剛烷(0.10 g，0.5 mmol)、乙交酯(1.45 g，12.5 mmol)、D,L-丙交酯(5.40 g，37.5 mmol)和辛酸亞錫(68.5 mg，質(zhì)量分數(shù)為1%)加入100 mL干燥Schlenk瓶中，在氬氣氛圍下，反應(yīng)體系保持130°C反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后加入50 mL二氯甲烷(CH2Cl2)溶解粗產(chǎn)物，除去不溶固體，用冰正己烷沉淀產(chǎn)物，經(jīng)真空干燥24 h得白色固體產(chǎn)品Ad-PLGA4(5.02 g，Mn, GPC=11 657，產(chǎn)率為86.2%)。將Ad-PLGA4(5.83 g，0.5 mmol)溶于CH2Cl2(50 mL)和三乙胺(TEA，0.81 g，8.0 mmol)并轉(zhuǎn)移至100 mL干燥Schlenk瓶。往反應(yīng)體系加入2-溴異丁酰溴(1.84 g，8.0 mmol)，在冰水浴中先反應(yīng)2 h，再在室溫下繼續(xù)反應(yīng)24 h。依次用稀鹽酸溶液(1 mol/L)、飽和NaHCO3溶液和去離子水各洗滌3次，有機相用無水MgSO4干燥過夜后旋蒸濃縮，用冰正己烷沉淀產(chǎn)物，經(jīng)真空干燥24 h得淡黃色固體Ad-(PLGA-Br)4(4.75 g，產(chǎn)率為81.5%)。

將Ad-(PLGA-Br)4(5.99 g，0.5 mmol)、DEAEMA(5.56 g，30.0 mmol)和PMDETA(34.7 mg，0.2 mmol)溶于50 mL無水四氫呋喃(THF)中，并轉(zhuǎn)移至150 mL干燥Schlenk瓶，隨后加入溴化亞銅(29.3 mg，0.2 mmol)。在氬氣保護下，反應(yīng)體系于65°C反應(yīng)24 h。反應(yīng)溶液通過中性氧化鋁柱除去銅鹽催化劑，洗脫液經(jīng)濃縮后緩慢滴至過量的冰正己烷中沉淀，通過離心收集沉淀物，經(jīng)真空干燥24 h得淡黃色塊狀固體Ad-(PLGAPDEAEMA)4(7.25 g，Mn,GPC=19 437，產(chǎn)率：74.6%)。

往100 mL單口燒瓶中加入Ad-(PLGA-PDEAEMA)4(3.89 g，0.2 mmol)、疊氮化鈉(130 mg，2 mmol)和溶劑N,N′-二甲基甲酰胺(DMF，50 mL)。反應(yīng)體系置于60°C下反應(yīng)48 h，將反應(yīng)溶液逐滴加至過量的冰去離子水中，通過離心收集固體沉淀物Ad-(PLGAPDEAEMA-N3)4。將Ad-(PLGA-PDEAEMA-N3)4(1.94 g，0.1 mmol)、炔基化mPEG(1.2 g，0.6 mmol)、2,2′-聯(lián)吡啶(9.4 mg，0.06 mmol)溶于50mL DMF，并轉(zhuǎn)移至150 mL干燥Schlenk瓶，迅速加入溴化亞銅(8.6 mg，0.06 mmol)。在氬氣的保護下，反應(yīng)體系保持60°C反應(yīng)48 h。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析袋中(截留分子量為7 500 Da)，用去離子水透析72 h除去未反應(yīng)原料和殘留的銅鹽。取透析袋中清液，冷凍干燥48 h，得白色粉末目標聚合物4sAd-PLGA-D-P(1.89 g，產(chǎn)率為70.1%)。

1.3 聚合物膠束及載藥膠束的制備

采用溶劑揮發(fā)法制備聚合物膠束[18]，將20 mg聚合物溶于10 mL丙酮，然后滴至20 mL去離子水中，室溫下攪拌24 h使丙酮完全揮發(fā)，通過0.45μm濾頭過濾可獲得聚合物膠束溶液。

選用DOX為模型藥物，采用透析法制備載藥膠束，將DOX·HCl(50 mg)溶于10 mL二甲基亞砜(DMSO)，再加入TEA(0.10 mL)，攪拌4 h獲得DOX堿溶液。將聚合物(100 mg)溶于20 mL DMSO，然后將聚合物溶液與DOX堿溶液混合，攪拌過夜。將混合液轉(zhuǎn)移至透析袋中(截留分子量為3 500 Da)，并用去離子水透析48 h。透析液通過0.45μm濾頭過濾后，通過冷凍干燥獲得載藥膠束固體粉末。

1.4 測試與表征

1.4.1樣品表征

采用核磁共振波譜儀(美國Bruker公司 AVANVE III 400 MHz型)表征聚合物的核磁共振氫譜(1H NMR)和核磁共振碳譜(13C NMR)，溶劑為DMF-d7；采用凝膠滲透色譜儀(美國Waters公司1515/2414型)測定聚合物的數(shù)均分子量(Mn)及分子量分布(Mw/Mn)，流動相為THF，流速1 mL/min。

對于孟晚舟被扣留一事，華為公司反應(yīng)迅速。12月6日，華為在官方微信發(fā)布聲明稱，孟晚舟是被加拿大當局暫時扣留，美國正在尋求對孟晚舟的引渡，她面臨紐約東區(qū)未指明的指控。

1.4.2 聚合物膠束表征

采用動態(tài)光散射儀(美國Brookhaven公司)測定聚合物膠束的粒徑及粒徑分布。樣品的形貌表征采用透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司，HT7700型號)，操作電壓為120 kV。

1.4.3臨界膠束濃度(CMC)測定

采用芘熒光探針法測定聚合物膠束的CMC值。將0.1 mL芘-丙酮溶液(6×10–5mol/L)加入10 mL的棕色容量瓶，避光靜置過夜待丙酮完全揮發(fā)。將聚合物溶液(濃度范圍0.000 1～0.100 0 mg/mL)加入容量瓶中，用去離子水將各容量瓶定容，混合均勻后在室溫下避光平衡24 h。利用熒光光譜儀(美國HORIBA Jobin Yvon公司，F(xiàn)luoroMax-4型)測定樣品溶液在300～350 nm波長范圍內(nèi)的激發(fā)光譜。其中，發(fā)射波長為373 nm，狹縫為5 nm。將樣品溶液在335 nm和332 nm處的激發(fā)光譜強度比值(I335/I332)與聚合物膠束溶液的濃度對數(shù)作圖。

1.4.4 聚合物膠束載藥性能

稱量4.0 mg載藥膠束溶于10 mL DMSO中，采用紫外?可見分光光度計(美國PerkinElmer公司，Lambda 950型)測定樣品在480 nm處的紫外吸收強度，根據(jù)紫外吸收強度與DOX濃度的標準曲線方程、式(1)和式(2)可計算聚合物膠束對DOX的載藥量(LC)和包封率(EE)[19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物的結(jié)構(gòu)表征

分別采用1H NMR和13C NMR表征聚合物的分子結(jié)構(gòu)及組成。結(jié)合CuAAC反應(yīng)前驅(qū)體的1H NMR譜圖和聚合物的1H NMR圖譜(見圖2(a))，圖2(b)表示各組信號峰的歸屬。在δ=1.25×10–6(b峰，寬重疊峰)、δ=4.99×10–6(d峰，兩重峰)和δ=5.27×10–6(c峰，四重峰)處的信號峰分別為疏水鏈段PLGA上—CH3、—CH2—和—CH—的氫質(zhì)子峰。金剛烷結(jié)構(gòu)上—CH2—信號峰在δ=1.25×10–6(a峰，寬重疊峰)處，與PLGA結(jié)構(gòu)中的—CH3吸收峰重疊。PDEAEMA鏈段中處于O原子和N原子間的—CH2CH2—信號峰在δ=2.92×10–6(f峰，三重峰)和δ=4.09×10–6(e峰，三重峰)處，而末端—CH3和—CH2—的信號峰在δ=1.10×10–6(h峰，兩重峰)和δ=2.74×10–6(g峰，四重峰)處。此外，在δ=3.58×10–6(k峰，單峰)處有一組強信號峰，為mPEG主鏈的—CH2—氫質(zhì)子峰。δ=7.38×10–6(m峰，單峰)處的一組弱質(zhì)子峰是聚合物結(jié)構(gòu)上1,4-二取代-1,2,3-三咪環(huán)的—CH—吸收峰，證明CuAAC反應(yīng)的成功進行。

圖2 Cu AAC反應(yīng)前驅(qū)體(a)和聚合物4sAd-PLGA-D-P(b)的1H NMR譜圖；聚合物4sAd-PLGA-D-P的13C NMR譜圖(c)Fig.2 1H NMR spectra of the precursor (a) and 4sAd-PLGA-D-P (b),13C NMR spectrum of 4sAd-PLGA-D-P (c)

通過GPC表征聚合物4sAd-PLGA-D-P的分子量及分子量分布，結(jié)果見圖3和表1。由圖3可知，聚合物的分子量分布呈現(xiàn)對稱的單峰分布，且結(jié)合表1中由GPC獲得的目標聚合物分子量與理論分子量相差不大，分子量分布較窄(Mw/Mn<1.50)，表明聚合反應(yīng)具有良好的可控性。對比目標產(chǎn)物及前驅(qū)體的數(shù)均分子量，相差7 565～7 841 g/mol，說明聚(乙二醇)單甲醚(Mn=2 000)通過點擊化學(xué)CuAAC反應(yīng)能較好地分別接到4sAd-PLGA-PDEAEMA四臂上。

圖3 聚合物的GPC洗脫曲線Fig.3 GPCtraces of polymers

表1 聚合物4sAd-PLGA-D-P的分子量及其分子量分布Table 1 Molecular weight and molecular weight distribution of 4sAd-PLGA-D-P

2.2 聚合物膠束CMC分析

CMC值是評價聚合物膠束穩(wěn)定性的一個非常重要的參數(shù)[17]。對于藥物遞送系統(tǒng)，CMC值越低，在血液循環(huán)中熱力學(xué)穩(wěn)定性越高，可避免由于藥物遞送系統(tǒng)不穩(wěn)定造成的抗癌藥物突釋或提前釋放[21]。從圖4可看出，3種聚合物膠束均具有較低的CMC值，表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。通過對比發(fā)現(xiàn)，PDEAEMA的鏈段長度越長，相應(yīng)的聚合物膠束CMC值越低，如Ad-PLGA-D15-P(0.003 1 mg/mL)

圖4 熒光激發(fā)光強度比I335/I332與聚合物膠束濃度對數(shù)關(guān)系圖Fig.4 Relationship between the intensity ratio I335/I332 and the logarithm of concentrations.

2.3 聚合物膠束的pH響應(yīng)性能

圖5表示聚合物膠束在不同pH值水溶液介質(zhì)中的粒徑變化趨勢。當pH值從7.4降低到5.0時，3種聚合物膠束的粒徑均明顯增大，表明聚合物膠束4sAd-PLGA-D-P具有顯著的pH響應(yīng)性能。這是因為PDEAEMA在中性條件下呈現(xiàn)疏水性，而在酸性條件下其側(cè)鏈上的叔氨基發(fā)生質(zhì)子化作用，PDEAEMA從疏水性向親水性轉(zhuǎn)變并延伸到水溶液中，導(dǎo)致聚合物膠束發(fā)生溶脹。此外，聚合物膠束中PDEAEMA鏈段越長，其粒徑隨pH值降低而增大越明顯，如當pH值從7.4降低至5.0，聚合物膠束的粒徑變化4sAd-PLGAD15-P(+163.8 nm)>4sAd-PLGA-D10-P(+110 nm)>4sAd-PLGA-D5-P(+39.4 nm)，表明PDEAEMA鏈段越長的聚合物膠束具有更好的pH響應(yīng)性。圖6為聚合物膠束4sAd-PLGA-D15-P分別在pH=7.4和pH=5.0條件下的TEM圖，從TEM圖中能更為直觀地看出聚合物膠束具有pH響應(yīng)性能，其粒徑隨著pH值的降低而增大，且在膠束外層還發(fā)現(xiàn)一定程度的溶脹現(xiàn)象。

圖5 pH值對聚合物膠束粒徑的影響Fig.5 Effects of pH on the particle size of polymeric micelles

圖6 聚合物膠束4sAd-PLGA-D15-P在不同pH下的TEM圖Fig.6 TEM imagesfor 4sAd-PLGA-D15-Pmicelle with different PH values

2.4 聚合物膠束的載藥性能

以DOX為模型藥物，探究聚合物膠束對抗癌藥物的載藥性能，采用DLS測定包載DOX后載藥膠束粒徑的變化情況，如表2所示。與空白聚合物膠束相比，包載DOX后載藥膠束的粒徑均增大。載藥膠束DOX@4sAd-PLGA-D5-P和DOX@4sAd-PLGA-D10-P的粒徑分別為102.9 nm和156.6 nm，粒徑小于200 nm有利于載藥膠束在腫瘤組織中滯留和積累(增強滲透和保留機制，EPR)[22]。但對于載藥膠束DOX@4sAd-PLGA-D15-P，粒徑稍大于200 nm(215.5 nm)。此外，載藥膠束DOX@4sAd-PLGA-D5-P、DOX@4sAd-PLGAD10-P和DOX@4sAd-PLGA-D15-P的載藥量分別為15.5%、22.8%和24.8%，均具有較好的載藥性能，優(yōu)于多數(shù)已報道的同類型四臂星狀聚合物，如(聚己內(nèi)酯)3-(聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯-b-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)3(12.8%～19.6%)[23]、聚(乙二醇)單甲醚-b-聚β氨基酯-b-聚乳酸(16.4%)[12]等。這是由于剛性大體積分子(金剛烷基)有利于支撐聚合物骨架為藥物包裹提供大的內(nèi)部空間[10,24]。聚合物膠束中pH響應(yīng)嵌段PDEAEMA的鏈段越長，其載藥性能越好，表明越長的PDEAEMA鏈段越有利于疏水性抗癌藥物的增溶和包載作用。

表2 載DOX聚合物膠束的載藥量、包封率和有效粒徑Table 2 Drug loading capacity, encapsulation efficiency and particle size of DOX-loaded micelles

2.5 DOX體外釋放性能評估

圖7表示載藥膠束在不同pH條件下的藥物釋放行為。在p H為7.4環(huán)境中，載藥膠束DOX@4sAd-PLGA-D5-P、DOX@4sAd-PLGA-D10-P和DOX@4sAd-PLGA-D15-P在80 h內(nèi)的DOX累計釋放量僅為16.2%、19.0%和20.9%，而當pH值降低至5.0時，載藥膠束釋放DOX的速率顯著加快，在80 h內(nèi)DOX的累計釋放量可分別高達66.7%，78.8%和85.2%，說明載藥膠束具有明顯的pH響應(yīng)性能和藥物控釋性能。此外，PDEAEMA鏈段長度越長，相應(yīng)的載藥膠束的DOX釋放量越多，DOX釋放速率越快，表明較長的PDEAEMA鏈段有利于聚合物膠束的pH響應(yīng)性能和藥物控釋性能。

圖7 載DOX聚合物膠束在不同pH條件下的DOX體外釋放曲線Fig.7 In vitro DOX release profiles of DOX-loaded micelles at different pH

2.6 DOX體外釋放機制

探究藥物從藥物遞送系統(tǒng)中釋放的過程及機制，對聚合物膠束的設(shè)計及制備具有十分重要的意義?；赗itger-Peppas模型，對載藥膠束DOX@4sAd-PLGA-D10-P的DOX釋放曲線分兩個階段(0～12 h和12～80 h)進行擬合，擬合曲線見圖8，擬合參數(shù)釋放級數(shù)n、常數(shù)k和相關(guān)系數(shù)R2列于表3。從表3中R2可知，載藥膠束在2階段的藥物釋放都表現(xiàn)出良好的線形關(guān)系。當pH=7.4時，聚合膠束兩個階段的n值均低于0.43，說明其藥物釋放行為主要受擴散?侵蝕作用共同控制。當pH=5.0時，0～12 h階段的n值為0.783 3，載藥膠束的藥物釋放行為屬于擴散?溶脹共同控制的反常傳輸機制，這也是由于PDEAEMA側(cè)鏈叔氨基發(fā)生質(zhì)子化，膠束發(fā)生溶脹行為，而在12～80 h階段的n值小于0.43，載藥膠束的釋放行為主要受擴散?侵蝕作用共同控制?？傮w而言，載藥膠束的釋放行為受環(huán)境pH值的影響，在前12 h階段，隨著環(huán)境pH值的下降，載藥膠束結(jié)構(gòu)慢慢溶脹，其釋放行為從擴散?侵蝕作用共同控制轉(zhuǎn)變?yōu)閿U散?溶脹共同控制的反常傳輸機制，而在12～80 h階段，載藥膠束的釋放機制均表現(xiàn)為擴散?侵蝕作用共同控制。

圖8 載藥膠束釋放量的lg (Mt/M∞)對釋放時間對數(shù)的擬合曲線Fig.8 Fitting plotsof lg (Mt/M∞) against lg t for DOX release data of DOX-loaded micelles

表3 DOX體外釋放數(shù)據(jù)的擬合參數(shù)Table 3 Fitting parameters of DOX release data

3 結(jié)論

結(jié)合開環(huán)聚合反應(yīng)、原子轉(zhuǎn)移自由基反應(yīng)和點擊化學(xué)CuAAC反應(yīng)，合成了3種含不同比例PDEAEMA鏈段的聚合物4sAd-PLGA-D5-P、4sAd-PLGA-D10-P和4sAd-PLGA-D15-P，聚合物分子量為25 498～30 218，分子量分布窄(Mw/Mn<1.50)。該聚合物在水溶液中可自組裝形成聚合物膠束，由于金剛烷基團的引入，聚合物膠束具有較好的穩(wěn)定性(CMC=0.0031～0.006 1 mg/mL)和載藥性能(DOX載藥量高達24.8%)。由于PDEAEMA在酸性條件下發(fā)生質(zhì)子化作用，聚合物膠束表現(xiàn)出明顯的pH響應(yīng)性，當pH=7.4時，載藥膠束在80 h內(nèi)的DOX累計釋放量僅為16.2%～24.8%，而當pH=5.0時載藥膠束的DOX累計釋放量明顯增加，可達66.7%～85.2%，說明聚合物膠束對DOX具有可控的釋放性能，可避免藥物在人體血液循環(huán)過程中的突釋，提高藥物的生物利用率。因此，pH響應(yīng)型聚合物膠束4sAd-PLGA-D-P可作為抗癌藥物遞送的潛在載體。