◆作者：劉雅娜 岳冰 王淼淼 李依峰 焦時(shí)陽(yáng) 王大紅,2

◆單位：1 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物資源開(kāi)發(fā)與利用實(shí)驗(yàn)室；2 河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心

豆粕是大豆榨油后獲得的副產(chǎn)品，其中不僅含有豐富的粗蛋白質(zhì)，而且氨基酸組成多樣，符合畜禽對(duì)氨基酸的需求，因此，豆粕被大量用于飼用蛋白原料。但是大豆中存在多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，會(huì)影響機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，直接飼喂導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物轉(zhuǎn)化率較低，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子限制豆粕在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用；另外，豆粕中的過(guò)敏原蛋白也限制了豆粕在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。因此，需要將豆粕中大分子蛋白轉(zhuǎn)變成肽類物質(zhì)和氨基酸等小分子物質(zhì)，進(jìn)而提高飼料蛋白的利用率。

目前，被廣泛采用處理豆粕的方法有酶解法和微生物發(fā)酵法。微生物發(fā)酵以豆粕為主要原料，使用細(xì)菌和真菌進(jìn)行發(fā)酵，并經(jīng)干燥制成的蛋白質(zhì)飼料。用于發(fā)酵的菌種主要有細(xì)菌和真菌，細(xì)菌主要是乳酸菌類和芽孢桿菌類，真菌主要是酵母類和霉菌類。豆粕經(jīng)發(fā)酵后，豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子被大幅度減少，提高了動(dòng)物消化吸收水平，并減少豆粕中其它營(yíng)養(yǎng)成分的流失；而且微生物發(fā)酵產(chǎn)生的益生菌對(duì)動(dòng)物腸道健康改善、降低抗生素使用等方面均有顯著效果。不同微生物對(duì)豆粕蛋白質(zhì)有不同的水解能力，且單菌發(fā)酵能力普遍較低，多菌種固態(tài)發(fā)酵是一種有效提高豆粕蛋白質(zhì)水解度的方式。酶解法利用蛋白酶將蛋白分解為多肽，產(chǎn)品具有肽類含量高、免疫活性強(qiáng)等特點(diǎn)，但易產(chǎn)生苦味物質(zhì)，影響適口性。菌酶協(xié)同發(fā)酵即采用蛋白酶對(duì)豆粕進(jìn)行處理，然后加入微生物進(jìn)行發(fā)酵，避免單獨(dú)使用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶不足的缺點(diǎn)，在發(fā)酵過(guò)程酵母菌和乳酸菌會(huì)產(chǎn)生多種香味物質(zhì)和有機(jī)酸，不僅調(diào)節(jié)產(chǎn)品的苦味，改善飼料適口性，同時(shí)發(fā)酵后的豆粕具有抑菌能力，從而延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。

本研究采取菌酶協(xié)同發(fā)酵法制備豆粕飼料，選用了枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌作為發(fā)酵菌種，同時(shí)選用了中性蛋白酶對(duì)豆粕進(jìn)行酶解，以發(fā)酵豆粕中肽和酸溶蛋白含量的變化為指標(biāo)，優(yōu)化了菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕的工藝。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和原料

豆粕、麥麩、玉米粉購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，粉碎后過(guò)40 目篩；中性蛋白酶≥200U/mg、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、牛肉膏、10%SDS、30%Acr-Bis、TEMED。

1.2 菌種

枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母粉5 g、蒸餾水1 L。YPD 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、酵母粉10 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1L。MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏8 g、酵母粉4 g、葡萄糖20g、檸檬酸三銨2 g、CH3COONa 5 g、K2HPO42 g、MgSO40.5 g、MnSO40.2 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1 L。

1.4 儀器

K1305A 型自動(dòng)定氮儀；UV-2100 紫外分光光度計(jì)；TG16-W 微量臺(tái)式高速離心機(jī)；A300 氨基酸自動(dòng)分析儀。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 種子的制備

將枯草芽孢桿菌接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，置于150 r/min 搖床，30℃培養(yǎng)34 h；嗜酸乳桿菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)34 h；產(chǎn)朊假絲酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基，置于200 r/min 搖床，28℃培養(yǎng)34 h。

1.5.2 固態(tài)發(fā)酵豆粕

將豆粕、麥麩、玉米粉按90∶5∶5 的比例分裝于500 mL燒杯中，115 ℃滅菌30 min，冷卻后，按5%接種量將種子液接入，加適量無(wú)菌水和糖蜜并攪拌均勻后，于37℃靜置培養(yǎng)發(fā)酵7天，每隔24 h 取一次樣，樣品60℃烘干、粉碎后-20℃保存。

1.5.3 菌體生物量和pH 測(cè)定

取不同發(fā)酵時(shí)間的樣品1.0g，加50 mL 蒸餾水，置于180 r/min 搖床中震蕩20 min，過(guò)濾，取上清液用pH 計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.5.4 發(fā)酵豆粕指標(biāo)測(cè)定

粗蛋白和酸溶蛋白含量測(cè)定采用凱氏定氮法，分別參照GB/T 6432-2018 飼料中粗蛋白的測(cè)定方法和GB/T 22492-2008大豆肽的測(cè)定方法；總游離氨基酸含量的測(cè)定采用茚三酮顯色法；多肽含量=酸溶蛋白含量-總游離氨基酸含量。

1.5.5 感官評(píng)價(jià)

參照感官分析標(biāo)準(zhǔn)GB 21172-2007 和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT 2218-2012，將適量樣品倒入干凈的平皿中，通過(guò)眼觀、鼻嗅、手捻等方法，分別評(píng)定樣品的顏色、氣味和質(zhì)地。具體標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵豆粕感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表

1.5.6 游離氨基酸分析

樣品處理步驟參考NY/T 1975-2010，采用氨基酸自動(dòng)分析儀，根據(jù)全自動(dòng)氨基酸分析儀A300 操作步驟進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 8.5 進(jìn)行處理，每個(gè)實(shí)驗(yàn)3 個(gè)平行，并用平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳接種時(shí)間的確定

根據(jù)圖1 可知，嗜酸乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母從32h 后處于穩(wěn)定期，枯草芽孢桿菌34h 后處于穩(wěn)定期?？紤]到方便實(shí)際的實(shí)驗(yàn)操作，故選用34h 為菌種的最佳接種時(shí)間。

圖1 不同菌種的生長(zhǎng)曲線

2.2 最適料水比的確定

基質(zhì)含水量影響培養(yǎng)系統(tǒng)中的氧氣供應(yīng)、氣體流動(dòng)等，是關(guān)系到發(fā)酵成敗的制約因素。根據(jù)豆粕發(fā)酵的感官評(píng)價(jià)表，不同料水比下的發(fā)酵情況得分見(jiàn)表2，結(jié)果顯示料水比為1∶0.7 和1∶0.8 發(fā)酵效果無(wú)明顯差異。當(dāng)培養(yǎng)基中的水分過(guò)低會(huì)導(dǎo)致氧氣不足，營(yíng)養(yǎng)也不能很好地溶于水中，導(dǎo)致其利用率降低；而水分太多會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)多孔性降低，不利于物料內(nèi)熱量的散發(fā)和氧氣的傳遞，影響菌的生長(zhǎng)和繁殖，且含水量過(guò)高也會(huì)增加后期的干燥成本。因此確定枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌發(fā)酵的最適料水比為1∶0.7。

表2 不同料水比對(duì)豆粕感官評(píng)定的影響

2.3 優(yōu)勢(shì)菌種的確定

測(cè)定料水比為1∶0.7、接種量為5%、發(fā)酵時(shí)間為72h 的枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌的粗蛋白含量，其結(jié)果如圖2 所示，枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌經(jīng)過(guò)72h 發(fā)酵后粗蛋白含量分別增加了12.2%、6.6%和3.2%，確定枯草芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)菌株?？莶菅挎邨U菌在發(fā)酵中產(chǎn)生中性蛋白酶和堿性蛋白酶且酶活力較為強(qiáng)盛，發(fā)酵豆粕由弱酸性轉(zhuǎn)變?yōu)閴A性；酵母菌在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中pH 值變化范圍較小呈偏弱酸性；乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生大量有機(jī)酸如乳酸、乙酸和丙酸等，且時(shí)間越長(zhǎng)作用越明顯，這導(dǎo)致其pH 值下降，但乳酸菌主要是利用碳水化合物通過(guò)生成的淀粉酶、纖維素酶等作用產(chǎn)酸及其他風(fēng)味物質(zhì)，而分泌的蛋白酶系比較少。

圖2 不同菌種對(duì)豆粕發(fā)酵的影響

2.4 混菌比例的確定

分別采用枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌之間比例為5∶2∶2、5∶3∶2、5∶2∶3，連續(xù)發(fā)酵7 天，每隔24 h 取一次樣，測(cè)定樣品中的粗蛋白、酸溶蛋白及肽含量的變化。由圖3 可知，發(fā)酵過(guò)程中粗蛋白含量都是呈先上升后下降趨勢(shì)，在120 h達(dá)到最大值，比發(fā)酵前分別增加了19%、14.1%和13.1%。圖4 和圖5 顯示酸溶蛋白和肽含量在5∶2∶2 最高，比發(fā)酵前分別增加了17.47%和15.86%。綜合考慮，三菌株間比例為5∶2∶2 最好。

圖3 不同菌種比例對(duì)粗蛋白含量影響

圖4 不同菌種比例對(duì)酸溶蛋白含量影響

圖5 不同菌種比例對(duì)肽含量影響

2.5 菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)豆粕品質(zhì)的影響

在枯草芽孢桿菌:產(chǎn)朊假絲酵母∶嗜酸乳桿菌=5∶2∶2 的基礎(chǔ)上添加0.1%中性蛋白酶，探討菌酶聯(lián)合對(duì)豆粕發(fā)酵品質(zhì)的影響。由圖6 可知，發(fā)酵后粗蛋白、酸溶蛋白和肽含量分別增加了20.25%、26%和23.69%。菌酶聯(lián)合發(fā)酵與混菌發(fā)酵相比，粗蛋白、酸溶蛋白、肽含量分別提高了1.25%、8.53%和7.83%，菌酶聯(lián)合發(fā)酵后效果明顯。

圖6 菌酶協(xié)發(fā)酵同對(duì)豆粕品質(zhì)的影響

2.6 蛋白降解情況分析

因?yàn)槎蛊芍泻卸喾N抗?fàn)I養(yǎng)因子，導(dǎo)致動(dòng)物消化不良和腸道微生物不平衡，其中抗原蛋白含量較多，豆粕中抗原蛋白主要由β-球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）組成，7S 蛋白是由三個(gè)亞 基α(約67 kD)、α’(約71kD)、β（約50 kD）組成，11S 蛋白是由酸性亞基（約40kDa）和堿性亞基（約20 kDa）組成。從圖7可以看出，該豆粕中存在7S 和11S 蛋白，豆粕經(jīng)過(guò)混菌發(fā)酵和菌酶協(xié)同發(fā)酵后，分子量約為97.2kD 的蛋白含量提高，但是7S 和11S 在兩種發(fā)酵條件下都得到大幅度減少，其中混菌+中性蛋白酶的發(fā)酵效果較好。

圖7 發(fā)酵豆粕中蛋白的降解情況

2.7 氨基酸含量變化分析

蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量的高低是衡量蛋白質(zhì)品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)之一。取發(fā)酵后的豆粕樣品為實(shí)驗(yàn)組，發(fā)酵前的樣品為對(duì)照組，按照NY/T 1975-2010樣品處理

對(duì)豆粕進(jìn)行前處理，然后通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)樣品中的氨基酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示。發(fā)酵前檢測(cè)出11 種氨基酸，含量為1.522 mg/100 mg，發(fā)酵后檢測(cè)出16 種氨基酸，為21.886 mg/100 mg，游離氨基酸含量提高了13 倍。

表3 發(fā)酵前后氨基酸含量

3 討論

本試驗(yàn)利用枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕，并結(jié)合中性蛋白酶處理，對(duì)豆粕的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行處理，優(yōu)化了發(fā)酵工藝條件。菌酶協(xié)同發(fā)酵處理后，可有效提高豆粕粗蛋白含量、肽含量、酸溶蛋白和游離氨基酸含量，與未發(fā)酵豆粕相比，粗蛋白、酸溶蛋白和肽含量分別增加了20.25%、26%和23.69%；而與混菌發(fā)酵相比，菌酶協(xié)同處理后粗蛋白、酸溶蛋白和肽含量分別提高了1.25%、8.53%和7.83%，菌酶聯(lián)合發(fā)酵豆粕效果顯著。

通過(guò)菌酶協(xié)同作用，使豆粕中大分子蛋白得到一定程度的降解，提高了豆粕中的小肽含量，小肽被分解為氨基酸、多肽和氨等小分子物質(zhì)，并去除了多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，有利于畜禽對(duì)豆粕的消化和吸收；在發(fā)酵過(guò)程中，由于酵母菌和乳酸菌的作用，使豆粕具有香味和一定的酸度，避免了添加酶帶來(lái)的不適口感，改善了豆粕的適口性，具有刺激食欲和增強(qiáng)牲畜免疫能力的作用。在微生物發(fā)酵過(guò)程中，采用的乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌是益生菌，這些益生菌可以改善畜禽腸道的微生態(tài)環(huán)境，抑制牲畜腸道有害菌群的繁殖，維持腸道益生菌群平衡，降低牲畜腹瀉率。通過(guò)蛋白酶的分解作用也能夠提高豆粕蛋白產(chǎn)生小肽物質(zhì)，其中有些小肽具有較好的免疫活性，常用的有酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶等，其中中性蛋白酶價(jià)格便宜，且具有一定的脫苦作用，在飼料工業(yè)常作為酶解豆粕的酶制劑。目前，菌酶協(xié)同處理表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢(shì)，也成為了關(guān)注熱點(diǎn)。張煜等（2018）通過(guò)菌酶協(xié)同發(fā)酵，能夠顯著改善豆粕的品質(zhì)。周爽等（2016）利用枯草芽孢桿菌和中性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵豆粕，發(fā)酵后的豆粕其小肽含量得到大幅度提高。目前采用單菌種協(xié)同酶處理的發(fā)酵研究較多，但混菌發(fā)酵可以彌補(bǔ)單菌發(fā)酵的不足，能夠更好地提高豆粕的營(yíng)養(yǎng)和降低生長(zhǎng)抑制因子。本研究主要集中在混菌發(fā)酵和中性蛋白酶聯(lián)合處理工藝的研究，后續(xù)可以采用其他蛋白酶聯(lián)合處理，并篩選出最佳的發(fā)酵溫度、pH、接種量等工藝參數(shù)，從而獲得更好的豆粕發(fā)酵工藝。

參考文獻(xiàn)：（略）