陳 晨，李秀波，王宏磊，劉義明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，國家飼料藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

獸用抗生素可以抑制病原微生物的生長，從而治療在養(yǎng)殖過程中畜禽產(chǎn)生的各種疾病，提高動物性食品的產(chǎn)量與質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國平均每年約有上千萬噸的獸藥廣泛應(yīng)用于動物疾病治療、預(yù)防和畜禽飼料添加劑等多個方面。但作為環(huán)境污染物，這些抗生素會有30%～90%以原形或代謝物形式從糞便中排出體外從而被直接施入農(nóng)田[1-2]，且殘留時間較長，在土壤中進(jìn)行殘留積累[3]。土壤中累積的獸藥一方面會破壞土著微生物菌落，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性細(xì)菌以及耐藥性細(xì)菌，從而使土壤環(huán)境中的抗生素抗性基因豐度增加以及產(chǎn)生耐藥性細(xì)菌[4-5]。國內(nèi)外研究表明，即使是污染較輕的地區(qū)也同樣檢測出含有氟喹諾酮類藥物等大量抗性基因[6-7]。另一方面，抗生素還會聯(lián)合土壤中的其他離子，影響土壤中生物群落的多樣性以及生物學(xué)的功能。形如磺胺甲惡唑與銅離子同時在土壤中存在的情況下會顯著降低土壤中總磷脂脂肪酸、細(xì)菌磷脂脂肪酸和真菌磷脂脂肪酸的含量[8]。另外土壤中的抗生素還可以通過食物鏈產(chǎn)生生物富集，對人類的健康帶來嚴(yán)重的危害[9]。因此,研究者對獸藥在環(huán)境土壤中的檢測技術(shù)越來越重視，針對復(fù)雜的土壤基質(zhì)開發(fā)出了不同的前處理技術(shù)。本文概述了國內(nèi)外重點(diǎn)地區(qū)的環(huán)境土壤中獸藥污染現(xiàn)狀，同時系統(tǒng)總結(jié)了近年來土壤樣品中獸藥靶向與非靶向篩查方法的樣品前處理技術(shù)，并對相關(guān)技術(shù)進(jìn)行了比較和展望，以期望促進(jìn)獸藥檢測方法的開發(fā)以及環(huán)境土壤中獸藥含量的檢測。

1 土壤中獸用抗生素的來源

獸用抗生素在所有的抗生素使用中占有很大的比重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有70%的抗生素使用在畜牧養(yǎng)殖行業(yè)，每年有超過9.7萬噸的抗生素投入畜禽養(yǎng)殖業(yè)中[10-11]。大量獸用抗生素的使用成為環(huán)境土壤中抗生素的主要來源。環(huán)境土壤中獸藥的輸入途徑主要有兩種：一是有機(jī)肥在土壤中直接施肥造成土壤中獸藥抗生素污染；二是使用污染的水資源對農(nóng)田進(jìn)行灌溉。其走向流路可以概括為圖1。

圖1 土壤中獸用抗生素的來源流程圖[23-24]Fig 1 Flow chart of antibiotic source[23-24]

1.1 施肥 隨著集約化養(yǎng)殖環(huán)境的迅速發(fā)展，含有各種抗生素的畜禽糞便量也不斷增加。這些糞便中的抗生素雖然會因?yàn)槎逊实忍幚硎侄谓到庖徊糠諿12]，但是單純的堆放處理抗生素降解不顯著[13-14]，在養(yǎng)殖場的糞便中仍然檢測出大量的抗生素，特別是四環(huán)素類與喹諾酮類。其中環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素和土霉素的最高含量超過1000 μg/kg[15]。這種被污染的糞便直接施用于土壤或者是經(jīng)過處理制成有機(jī)肥施用于土壤都會造成土壤中獸藥抗生素的殘留，經(jīng)過累計(jì)以及生物鏈的富集，從而流向人體，對人類以及整個生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生威脅。有研究表明相對于不使用豬糞的土壤，長期使用豬糞的稻田表層土壤中四環(huán)素含量具有明顯的累積現(xiàn)象，濃度范圍為：ND～344.74 μg/kg，且長期使用豬糞會造成稻田表面的抗性基因的豐度顯著升高[16]。

1.2 灌溉 獸藥抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中也廣泛使用[17]。我國很多淡水養(yǎng)殖地區(qū)的養(yǎng)殖水體中已經(jīng)有一定量的磺胺類和喹諾酮類抗生素的殘留，并可能威脅到水生生物的安全[18-19]。其被污染過的水質(zhì)直接流入水體或沉降富集于底泥中造成環(huán)境水的污染[20]，被污染的環(huán)境水資源在對農(nóng)田等進(jìn)行灌溉的時候就會造成土壤中不同程度的獸藥抗生素累積[21-22]。

2 土壤中獸用抗生素的污染狀況

在我國的各個區(qū)域內(nèi)的土壤中都不同程度的檢出了獸藥抗生素殘留。其中包括畜禽養(yǎng)殖場周邊土壤、蔬菜基地和城市土壤等。有研究指出城市土壤中的抗生素濃度高于農(nóng)業(yè)土壤[25]。檢出量最多的抗生素有四環(huán)素類、喹諾酮類和磺胺類，有的甚至已經(jīng)超出了獸藥國際協(xié)調(diào)委員會(VICH)籌劃指導(dǎo)委員會提出的土壤抗生素毒害效應(yīng)的觸法值(100 μg/kg)，具有一定的生態(tài)風(fēng)險。但是各個地方土壤中的抗生素檢出濃度具有較大的差異，發(fā)生重大差異的原因可能是因?yàn)槊總€地方的施肥與灌溉的習(xí)慣不同。有文獻(xiàn)指出環(huán)境土壤中獸藥抗生素殘留的含量與土壤采集的深度、使用不同動物糞便施肥都有很大的關(guān)系[26]。Gu等指出徐州市畜禽養(yǎng)殖場土壤中氟喹諾酮類抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類化合物的總濃度遠(yuǎn)高于磺酰胺類[27]。氟喹諾酮類與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在土壤中降解較慢，吸附性較長，能在土壤中穩(wěn)定的存在。四環(huán)素類抗生素由于其廣譜性與價格低廉所以廣泛應(yīng)用畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，但是這些抗生素不能完全被機(jī)體吸收，而大部分以原形或者代謝產(chǎn)物的形式從體內(nèi)排出，并隨著農(nóng)用最終在土壤中進(jìn)行吸附積累，進(jìn)而危害農(nóng)業(yè)生態(tài)安全。農(nóng)業(yè)土壤中四環(huán)素類抗生素已經(jīng)成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)環(huán)境污染及生態(tài)安全研究的熱點(diǎn)之一。具體的檢出情況如表1所示。

表1 抗生素在環(huán)境土壤中的殘留濃度Tab 1 Residual concentration of antibiotics in Environmental Soil

3 土壤中獸用抗生素的檢測前處理技術(shù)

獸用抗生素殘留的檢測方法主要有免疫分析法與儀器分析法，但是在檢測之前樣品的制備一直作為整個藥物殘留檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因?yàn)闄z測獸藥殘留的基質(zhì)成分比較復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)影響比較嚴(yán)重，另外藥物以及其代謝產(chǎn)物各種物理化學(xué)性質(zhì)不同，在不同的酸堿濃度下顯示不同的電離特性[39]，從而對前處理的條件要求比較嚴(yán)苛。由于干擾獸藥多殘留分析的原因比較多，且在建立以及優(yōu)化獸藥殘留預(yù)處理方法的時候，必須考慮減少使用有機(jī)化學(xué)溶劑，從而減少對環(huán)境的污染，除此以外，良好的預(yù)處理方法要盡可能減少其消耗的時間、精力、以及成本，提高被檢測目標(biāo)的回收率。所以很多年來，藥物多殘留分析中樣品預(yù)處理方法一直是檢測的瓶頸之一。近些年來，因?yàn)槿藗儗ΛF藥殘留含量的關(guān)注度較多，對殘留獸藥的認(rèn)識更加深刻，所以針對獸藥殘留建立了大量的預(yù)處理方法。傳統(tǒng)的預(yù)處理技術(shù)有：固相萃取法、QuEChERS、加速溶劑萃取法、液-液萃取法、索氏提取法、超聲波提取法等。土壤基質(zhì)比較復(fù)雜，其中1%～10%動植物腐爛而形成的土壤腐殖質(zhì)，還有巖石風(fēng)格所形成的礦物質(zhì)。近十年來開發(fā)的方法中使用的提取液大多數(shù)都選擇了EDTA-檸檬酸緩沖液，其在檢測不同土質(zhì)的時候也僅僅只是優(yōu)化了檸檬酸鹽緩沖液與有機(jī)溶劑。選擇EDTA-Mcllvaine緩沖液提取土壤中抗生素及其降解產(chǎn)物，其原因也是因?yàn)楸苊猥F藥抗生素與金屬離子發(fā)生螯合作用，從而增加獸藥的提取效果。由于土壤基質(zhì)中的干擾物較為復(fù)雜,往往會與待測的喹諾酮類抗生素在霧滴表面離子化過程中產(chǎn)生競爭,進(jìn)而影響電噴霧接口處的離子化效率,即產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。因此，為盡量避免基質(zhì)效應(yīng)降低測定方法的準(zhǔn)確度，樣品的前處理?xiàng)l件優(yōu)化至關(guān)重要。

3.1 固相萃取技術(shù) 固相萃取技術(shù)(solid-phase extraction，SPE)是一項(xiàng)常用的對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分離、濃縮、凈化和介質(zhì)交換的同時具有多功能的樣品預(yù)處理技術(shù)，廣泛用于衛(wèi)生，環(huán)境，制藥，臨床，食品和工業(yè)化學(xué)等領(lǐng)域，目前是土壤中獸藥抗生素多殘留檢測最常用的前處理凈化方法。大多數(shù)研究都使用超聲震蕩提取與該技術(shù)連用，隨后通過SAX與HLB小柱串聯(lián)的前處理方法[40-41]。郭欣妍等利用磷酸鹽緩沖液：乙腈=1∶1超聲萃取，SAX-HLB串聯(lián)固相萃取柱凈化與富集，檢測土壤中喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和內(nèi)酰胺類5類25種抗生素，回收率為51.3%～86.4%。并且串聯(lián)SAX強(qiáng)陰離子交換柱后，土壤樣品的基質(zhì)效應(yīng)降低為75%～160%之間[40]。SUN利用加速溶劑提取與SAX-HLB串聯(lián)固相萃取連用技術(shù)對土壤中的四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類與磺胺類抗生素進(jìn)行提取。多種技術(shù)連用大大減少了土壤基質(zhì)效應(yīng)，回收率均在67.3%～97.4%之間[42]。曹勝男等使用甲醇：EDTA=1∶1溶液提取，超聲提取與SPE凈化，對施糞土壤中四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類4類15種獸藥抗生素進(jìn)行提取，四環(huán)素類的加標(biāo)回收率為73.2%～97.4%，磺胺類為71.7%～108.4%，喹諾酮類為78.1%～112.8%，大環(huán)內(nèi)酯類回收率為81.2%～98.6%[43]。SPE技術(shù)在檢測土壤中獸藥抗生素多殘留的應(yīng)用見表2。

表2 固相萃取技術(shù)在環(huán)境土壤中多類獸藥殘留同時分析中的應(yīng)用Tab 2 SPE technology in the soil of the veterinary antibiotics residue

續(xù)表

3.2 QuEChERS技術(shù) QuEChERS是Anastassiades等[44]在2003年開發(fā)的一種消耗時間少，花費(fèi)少的一種新型的前處理技術(shù)。起初應(yīng)用于蔬菜中農(nóng)藥的多殘留檢測，后來因?yàn)椴僮鞣奖?，被引用到獸藥殘留等各個領(lǐng)域中。QuEChERs前處理技術(shù)可以利用吸附填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互吸引，從而有效地去除檢測物中的有機(jī)酸、糖類、多環(huán)芳烴等成分，使被檢測物質(zhì)回收率良好，該方法在基質(zhì)比較復(fù)雜的土壤獸藥抗生素的檢測中更實(shí)用。QuEChERS技術(shù)與SPE技術(shù)相似，先使用提取液進(jìn)行提取，而后進(jìn)行濃縮，與SPE技術(shù)的不同之處在于它選用的是合適的具有吸附作用的QuEChERS鹽包作為吸附劑，例如C18粉[45]，石墨烯、碳納米材料等，對藥物或者雜質(zhì)進(jìn)行吸附，使被檢測物回收率提高的同時減少基質(zhì)效應(yīng)所產(chǎn)生的影響。有研究表明，相比于固相萃取技術(shù)，QuEChERs更加方便，同時回收率更好[46]。使用QuEChERs檢測土壤中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、林可胺類，其在添加范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，而且回收率都可以達(dá)到61%～118%[46-49]。在進(jìn)行土壤中獸藥抗生素等多殘留分析時，除了環(huán)丙沙星、馬波沙星等氟喹諾酮類、莫能菌素回收率很低以外，其他抗生素使用QuEChERS提取的結(jié)果均優(yōu)于加壓萃取技術(shù)。且相比于加壓萃取技術(shù)，QuEChERS更適合分析大環(huán)內(nèi)酯類阿奇霉素和替米考星、硝基咪唑類、四環(huán)素類和鏈霉素維吉尼亞霉素[50]。QuEChERS技術(shù)在檢測土壤中獸藥抗生素多殘留的應(yīng)用見表3。

表3 QuEChERS技術(shù)在環(huán)境土壤中多類獸藥殘留同時分析中的應(yīng)用Tab 3 QuEChERS technology in the soil of the veterinary antibiotics residue

QuEChERs凈化技術(shù)在檢測其他基質(zhì)的獸藥多殘留方面已有應(yīng)用報道，但目前在土壤基質(zhì)中同時檢測多類藥殘留方面的研究不多。但其操作簡單，回收率好，重復(fù)程度好，其在未來將很好的應(yīng)用于土壤中獸藥抗生素的檢測。

3.3 液-液萃取技術(shù) 液-液萃取技術(shù)(liquid-liquid extraction，LLE)主要通過目標(biāo)待測物質(zhì)在不同的兩種液體中的溶解度不同而提取，其具有提取和凈化兩種作用。陳海燕等利用0.1 mol/L氫氧化鈉：甲醇=5∶5提取，二氯甲烷萃取，經(jīng)過高效液相色譜-熒光檢測器檢測土壤中三種磺胺類的獸藥抗生素，回收率為74.17%～104.35%，同時檢測線可以達(dá)到2.5 μg/kg[51]。另外還有SUN[52]使用LLE技術(shù)檢測土壤中的喹諾酮類抗生素，其回收率也都大于90%，且批內(nèi)與批間變異均不超過5%。但是相對于其他的前處理方法，液-液萃取技術(shù)在進(jìn)行土壤中獸藥抗生素多殘留檢測時，一般僅僅適用于同一類的獸藥抗生素，目前針對土壤中多類多種獸藥抗生素的檢測使用液-液萃取技術(shù)的鮮有人研究。況且液-液萃取需要較多的有機(jī)試劑，這對環(huán)境會造成更進(jìn)一步的破壞。

3.4 加速溶劑萃取技術(shù) 加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction，ASE)又稱加壓液相萃取(PLE)，其全自動程度很高，可以連續(xù)的進(jìn)行提取過濾。在高溫高壓的條件下，提高目標(biāo)獸藥抗生素在提取劑中的溶解度，從而提高前處理的回收率。孫寶利等建立了一種ASE-HPLC-MS/MS檢測方法用于測定土壤中四環(huán)素類抗生素殘留含量，回收率均在60.1%～103.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.6%～4.8%之間[53]。楊靜等聯(lián)合加速溶劑萃取與固相萃取技術(shù)，檢測土壤中的6種喹諾酮類的抗生素，將基質(zhì)效應(yīng)因子控制在0.84～1.04之間，且回收率在60.9%～89.9%，很好的減少了土壤基質(zhì)對質(zhì)譜檢測器產(chǎn)生干擾問題[54]。Marie-Virginie Salvia[55]利用甲醇∶乙腈∶0.2M檸檬酸(pH=4.5)=40∶40∶20(V/V/V)提取液，經(jīng)過快速溶劑萃取，利用LC-MS/MS檢測土壤中喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素，回收率喹諾酮類>87%，但是四環(huán)素類回收率在在25.4%～41.7%之間。所以快速溶劑萃取技術(shù)比較適用于檢測土壤中同一類的獸藥抗生素。但是同時檢測多類的抗生素時，效果不是很理想。

4 展 望

環(huán)境土壤中的抗生素殘留檢測技術(shù)還處于正在發(fā)展的階段，面臨著一系列的問題。常用的檢測手段有理化檢測手段分析與免疫檢測。在市面上常見的快檢方法ELISA、膠體金等使用針對一種靶標(biāo)物的檢測，不能滿足對多獸藥殘留的高通量多元分析要求。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法雖然靈敏度高，但是實(shí)驗(yàn)室條件要求比較高，操作復(fù)雜，費(fèi)時費(fèi)力，成本比較高，盡管在多殘留檢測手段中出現(xiàn)了定量檢測的生物芯片技術(shù)，達(dá)到樣品前處理的集成化以及操作靈敏度與特異性來說相對較好，但是液質(zhì)聯(lián)用仍然是現(xiàn)階段最常用的技術(shù)。本文針對近十年土壤中抗生素的檢測方法相互比較，從前處理的提取液、前處理技術(shù)等多方面進(jìn)行闡述。土壤中獸藥抗生素的檢測現(xiàn)狀：一是開發(fā)優(yōu)化的方法比較單一，大多數(shù)開發(fā)方法還集中于提取液以及萃取技術(shù)的優(yōu)化；二是現(xiàn)在大多數(shù)的環(huán)境中獸藥抗生素的檢測方法還都處于靶向的檢測，針對非靶向檢測技術(shù)還不成熟，因?yàn)橥寥乐械墨F藥種類復(fù)雜，含量較多。所以非靶向的檢測技術(shù)的發(fā)展有利于環(huán)境中土壤中的抗生素含量的檢測，非靶向的檢測技術(shù)的發(fā)展就需要非靶向的譜圖庫的建立。

綜上所述，高分辨質(zhì)譜是環(huán)境土壤中抗生素檢測的強(qiáng)有力的工具，但是在該檢測技術(shù)下還需要更多的研究：①高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)在環(huán)境水樣品中已經(jīng)開始逐漸發(fā)展，但是在土壤中的環(huán)境檢測還鮮有報道，所以使用高分辨質(zhì)譜對土壤樣品的前處理凈化過程還需要進(jìn)一步發(fā)展探索，同時在前處理過程中考慮多種提取凈化步驟連用是將來的發(fā)展趨勢；②高分辨的非靶向技術(shù)在環(huán)境中已經(jīng)開始發(fā)展起來，國內(nèi)已經(jīng)發(fā)布了關(guān)于高分辨質(zhì)譜檢測水環(huán)境中獸藥的國家標(biāo)準(zhǔn)[69]，但是在土壤中的關(guān)注度還是比較低，所以高分辨質(zhì)譜的檢測技術(shù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定，或者是非靶向的抗生素篩查將是未來發(fā)展的方向。