劉子倩 李哲 王胤 曾煥玉 李培峰

摘要：

為了研究藥物阿霉素作用前后胃癌細胞中l(wèi)ncRNA表達的變化，采用微陣列技術(shù)分析AGS細胞中l(wèi)ncRNA和mRNA的基因表達譜，運用基因本體（GO）分析和KEGG分析探究基因表達功能，通過實時定量PCR實驗對添加DOX前后AGS細胞中具有功能的lncRNA表達水平進行分析。研究結(jié)果顯示，添加DOX后的AGS細胞lncRNA和mRNA的表達出現(xiàn)顯著異常，這與多種生物過程、細胞成分和分子功能有關(guān)。

關(guān)鍵詞：

胃癌，長鏈非編碼RNA，阿霉素，微陣列分析，實時定量PCR

中圖分類號： R735.2

文獻標(biāo)志碼：A

收稿日期：2021-04-19

基金項目：

國家自然科學(xué)基金海外青年基金（批準(zhǔn)號：82050410450、81850410551）資助;山東省自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號ZR2019BH014）資助。

通信作者：

曾煥玉（AUNG Lynn Htet Htet），女，博士，主要研究方向為利用高通量測序，生物信息學(xué)，細胞生物學(xué)方法研究衰老及心腦血管疾病的機理機制;李培峰，男，博士，教授，主要研究方向為神經(jīng)元衰老、自由基生物醫(yī)學(xué)、細胞凋亡與心血管疾病及其分子機制的研究。E-mail：peifli@qdu.edu.cn

癌癥的發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]，已嚴(yán)重影響到人們的身體健康，目前還沒有行之有效的治愈方式[2]。胃癌常發(fā)生于胃腸道系統(tǒng)中，是世界上最常見的六種惡性腫瘤之一，死亡率位列第二，僅排在肺癌之后[3-4]。胃癌組織中發(fā)現(xiàn)了許多異常表達的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）[5]，并與癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。人類基因組中有關(guān)蛋白質(zhì)編碼的基因約20 000 個，但僅占總基因組的2%[7]，而大多數(shù)其他基因被轉(zhuǎn)錄生成非編碼RNA（ncRNA）[8]。lncRNA是ncRNA中一個獨立的分支，是一種非蛋白質(zhì)編碼RNA[9]，長度超過200 個核苷酸[10]。隨著高通量測序等生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，lncRNA被發(fā)現(xiàn)在細胞周期調(diào)控、X染色體失活、細胞分化等包括胃癌在內(nèi)的許多疾病的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[11-12]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在某些疾病中可能是一個新的生物標(biāo)志物或潛在的治療位點[13]。阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種廣譜抗癌藥，屬于蒽環(huán)類藥物[14]，于20世紀(jì)60年代從鏈霉菌[15]中分離出來，主要用于急性白血病、惡性淋巴瘤、胃癌、乳腺癌等多種癌癥的化療[16]。DOX可以插入DNA并抑制拓撲異構(gòu)酶II，最終破壞雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，阻礙蛋白的合成[17-18]。lncRNA在胃癌中的研究雖已有報道，但機制尚不清楚。本研究主要運用生物信息學(xué)分析方法，通過對測序數(shù)據(jù)的分析得到胃癌中差異表達的lncRNA圖譜，總結(jié)lncRNA的作用通路圖，最終篩選出上調(diào)差異最大的lncRNA。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與收集處理

（1）實驗中所用到的AGS細胞來自中國科學(xué)院細胞研究所。在進行微陣列芯片分析實驗時，實驗組AGS細胞用2 μmol DOX處理6 h后收集;（2）AGS細胞培養(yǎng)基成分為：10 %胎牛血清（FBS）和1 %雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基;（3）培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃，95 %空氣和5 %二氧化碳;（4）細胞的傳代采用胰酶法，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌細胞后，用025 %含EDTA的胰酶消化處理，隨后用新的培養(yǎng)基重懸細胞分盤培養(yǎng)。

1.2 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR

1.2.1 RNA提取 在RNA提取實驗中，為避免RNA發(fā)生降解，整個實驗耗材需使用無RNA酶，過程需在冰上進行。實驗前提前將低溫離心機冷卻至4 ℃。使用 Trizol 法提取 RNA：（1）在每盤細胞樣品中加入1 mL Trizol試劑，冰上靜置5 min，收集細胞至15 mL EP管中，冰浴5～10 min;（2）向步驟（1）的EP管中加入200 μL氯仿，用力上下震蕩15 s后，在冰上靜置10 min;（3）4 ℃，12 000 rpm對步驟（2）中樣品離心15 min，輕輕取出，上層無色透明水相為RNA;（4）用移液槍將上層水樣吸取到新的EP管中，加入等體積的異丙醇，輕微震蕩混勻，冰上靜置10 min，4 ℃，12 000 rpm離心10 min;（5）加入預(yù)冷過的75 %乙醇清洗RNA 2次，4 ℃，12 000 rpm離心5 min，去除上清留底部沉淀;（6）干燥2 min，加入20 μL DEPC水溶解，-80 ℃冷凍保存。采用Nanodrop濃度檢測儀測量并記錄RNA樣品A260 nm/A280 nm的比值，當(dāng)A260 nm/A280 nm在18～20范圍內(nèi)時，提取的RNA純度合格，否則RNA可能有污染。

1.2.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄實驗 （1）在無RNA酶的200 μL tube中加入2 μL的5×DNA Eraser buffer、1 μL的DNA Eraser、RNA總量不超過1 μg的樣本，若總體系不夠10 μL用DEPC水補齊，混合均勻后在PCR儀中運行42 ℃，2 min程序;（2）在步驟（1）管中加入Primer mix和Enzyme mix各1 μL、4 μL的Buffer 2，4 μL DEPC水使得管內(nèi)總體系為20 μL，渦旋混勻后瞬離;（3）在PCR儀中運行程序：37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，降溫至4 ℃停止反應(yīng);（5）反應(yīng)產(chǎn)物-20 ℃保存。

1.2.3 qRT-PCR實驗 （1）qRT-PCR引物設(shè)計：qRT-PCR實驗中所用到的引物信息如表1所示，β-actin基因用作對照。

（2）反應(yīng)成分：每個反應(yīng)孔內(nèi)加2×SYBR 10 μL，F(xiàn)orward/Reverse引物各04 μL，cDNA樣本1 μL，水82 μL，總體系20 μL。每個樣品設(shè)置三個重復(fù)孔實驗。

（3）qRT-PCR反應(yīng)條件共分三步：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃反應(yīng)5 s，60 ℃反應(yīng)1 min，循環(huán)35次;95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃保溫1 min。

（4）相對表達量分析：擴增實驗結(jié)束后，儀器Bio-Rad CFX manager 31自動生成擴增曲線，隨后進行數(shù)據(jù)處理分析。

1.3 微陣列分析

采用安捷倫陣列平臺對AGS細胞和DOX處理6 h的AGS細胞進行微陣列分析，從中提取RNA后再純化出mRNA，用隨機引物法擴增每個樣本，沿轉(zhuǎn)錄本全長轉(zhuǎn)錄成無3′端偏差的熒光cRNA。然后與人類lncRNA陣列v30雜交（8×60K， Arraystar），清洗載玻片后用安捷倫掃描儀掃描陣列。對所得原始數(shù)據(jù)進行分位數(shù)歸一化，標(biāo)記出對照組和DOX組的lncRNA和mRNA。篩選二者之間的改變倍數(shù)，找出有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達lncRNA和mRNA。至少發(fā)生2倍倍數(shù)變化的lncRNA才能被篩選和鑒定出來（P≤005）。

1.4 編碼基因功能分析

對篩選出的lncRNA和mRNA進行GO和KEGG通路分析。GO分析將lncRNA在AGS細胞中從生物學(xué)過程（Biological Process，BP）、細胞成分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）三個相關(guān)方面進行解釋。KEGG通路分析對lncRNA生物學(xué)路徑進行富集，使得lncRNA的生物學(xué)功能圖像化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

運用GraphPad 8統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，單因素變量兩組之間的比較用t檢驗統(tǒng)計，多組間均數(shù)的比較則用方差分析。*P<005被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 胃癌細胞中l(wèi)ncRNA和mRNA表達譜

采用對照組AGS細胞和實驗組DOX處理6 h后的AGS細胞，提取RNA，進行微陣列芯片分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與AGS細胞相比，DOX處理6 h后的AGS細胞中出現(xiàn)異常表達的lncRNA共有10 981個，mRNA共有8 294個（fold change≥2，P≤005），如圖1所示。這表明DOX的加入使得胃癌細胞中l(wèi)ncRNA和mRNA發(fā)生了異常變化，其中，上調(diào)差異最大的是RP11-20B244（上調(diào)了1 462689 266倍），而下調(diào)最明顯的lncRNA是RP11-881L21（下調(diào)了1 131864 075倍）。

2.2 GO分析

本實驗的GO分析體現(xiàn)了AGS細胞中生物學(xué)過程、蛋白的細胞定位和分子功能方面的情況（P≤005）。由圖2可知，上調(diào)的lncRNA主要在細胞死亡、細胞質(zhì)成分、蛋白質(zhì)結(jié)合方面發(fā)揮作用。下調(diào)的lncRNA主要在RNA加工、胞內(nèi)成分、RNA結(jié)合方面發(fā)揮作用。

2.3 KEGG通路分析

分子間相互作用、反應(yīng)和關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的通路圖如圖3所示?？芍?，與lncRNA共表達的mRNA參與了腫瘤通路的調(diào)控包括：細胞周期、細胞凋亡、轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路、p53信號通路、VEGF信號通路、PPAR信號通路、Wnt信號通路、PI3K-Akt信號通路、cytokine-cytokine受體相互作用、MAPK信號通路、mTOR信號通路、Jak-STAT信號通路、ErbB信號通路和ECM受體相互作用等。圖3（b）提示lncRNA很有可能通過下游蛋白發(fā)揮作用。

2.4 qRT-PCR驗證篩選差異表達最大的lncRNA

通過qRT-PCR實驗驗證lncRNA結(jié)果在微陣列分析中的準(zhǔn)確性，篩選差異表達最大的lncRNA?；谇捌趯λ袦y序所得lncRNA數(shù)據(jù)的功能性分析，選取13個在功能上上調(diào)和下調(diào)變化較大的lncRNA進行qRT-PCR實驗驗證。由圖4可知，lncRNA ENST00000515691、ENST00000427276、ENST00000556144、ENST000000444956、ENST000000422764、TCONS_00023590和ENST00000458351表達上調(diào)，而lncRNA ENST00000450727、ENST00000300458、TCONS_00016151、ENST00000574739、TCONS_00029013和TCONS_00005314的表達下調(diào)，這與測序所得數(shù)據(jù)一致。圖4（d）表明所有驗證的異常表達的lncRNA在DOX組與對照組之間的差異，證實了微陣列分析的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，實驗數(shù)據(jù)由三次以上實驗的平均值計算所得。

3 討論

胃癌具有高度的異質(zhì)性和惡性[19]，早在2012 年就有數(shù)據(jù)記載，70% 以上的新增胃癌病例發(fā)生在亞洲、中歐、東歐和拉丁美洲等地的發(fā)展中國家[20-22]。近年來，lncRNA已由最初的“無功能副產(chǎn)物”[23]，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橛锌裳芯恳饬x的“明星分子”[24]。因此，研究胃癌與lncRNA之間調(diào)控關(guān)系顯得格外重要。

本研究利用lncRNA能參與許多病理過程[25]和DOX能致使相關(guān)的癌細胞凋亡增加的特點[26-27]，來分析DOX作用前后的AGS細胞lncRNA和mRNA的表達差異，鑒定出10 981個異常表達的lncRNA，其中5 673個lncRNA表達上調(diào)，5 308個lncRNA表達下調(diào)。還有8 294個異常表達的mRNA，其中有4 778個mRNA表達上調(diào)，3 516個mRNA表達下調(diào)。GO 和 KEGG 富集分析顯示失調(diào)的lncRNA可能在細胞后續(xù)的生命過程中發(fā)揮作用，提示胃癌的發(fā)生發(fā)展可能與lncRNA異常表達有關(guān)[28]。有研究表明lncRNA TUG1在乳腺癌組織中高表達，構(gòu)建敲除TUG1的siRNA表達載體可以調(diào)節(jié)乳腺癌細胞對DOX的敏感性[29-30]。對比本研究篩選出的差異表達最明顯的lncRNA ENST00000458351，DOX處理后lncRNA ENST00000458351表達升高且與對照組之間差異明顯，提示可以從lncRNA ENST00000458351入手展開對胃癌中l(wèi)ncRNA調(diào)控變化的研究，構(gòu)建敲除lncRNA ENST00000458351的siRNA表達載體，以期發(fā)現(xiàn)新的胃癌診斷生物標(biāo)志物。

4 結(jié)論

本研究通過微陣列技術(shù)分析，運用生物信息學(xué)方法對DOX處理的胃癌細胞進行全面系統(tǒng)分析，篩選出13個具有功能差異的lncRNA。這些lncRNA可能是胃癌潛在的治療靶點，其中上調(diào)最明顯的是lncRNA ENST00000458351，今后將重點研究lncRNA的調(diào)控機制。

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Abstract：

In order to study the changes of lncRNA expression in gastric cancer cells before and after DOX treatment， microarray analysis was used to analyze the gene expression profiles of lncRNA and mRNA in AGS cells. GO analysis and KEGG analysis were used to explore gene expression function. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to analyze the expression levels of functional lncRNA in AGS cells before and after DOX addition. The results show that the expressions of lncRNA and mRNA in AGS cells are significantly abnormal after DOX addition. The occurrence of such abnormalities is associated with a variety of biological processes， cellular components， and molecular functions.

Keywords：

gastric cancer; long non-coding RNA; doxorubicin; microarray analysis; qRT-PCR