丁小芬 周友龍 田明月 賈夢(mèng)雅 李彥華 楊志孟

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是一種以軟骨破壞、軟骨下骨改變、骨贅形成及韌帶和半月板改變?yōu)樘卣?，多?jiàn)于老年人關(guān)節(jié)退行性疾病〔1〕，軟骨破壞是膝骨性關(guān)節(jié)炎主要的病理狀態(tài)〔2〕。膝骨性關(guān)節(jié)炎被認(rèn)為是65歲以上人群致殘的主要原因，由于肥胖和人口老齡化，其發(fā)病率正在上升〔3〕。調(diào)查顯示，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎60歲以上患病率達(dá)50%，在75歲以上人群中患病率高達(dá)80%，致殘率為53%，發(fā)病率的增加帶來(lái)了嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題〔4～6〕。Wnt信號(hào)通路是調(diào)節(jié)發(fā)育、生長(zhǎng)、內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病中的關(guān)鍵生物過(guò)程，特別是在關(guān)節(jié)和骨骼中，膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和嚴(yán)重程度與關(guān)節(jié)軟骨中Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路明顯相關(guān)〔7〕。本文通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路探討膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、研究軟骨代謝對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)作用，為臨床診療提供支持。

1 Wnt信號(hào)通路

Wnt名字的由來(lái)：Wingless最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，是可以導(dǎo)致翅膀組織缺失的基因。Int1基因發(fā)現(xiàn)位于小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)整合位點(diǎn)附近，且與Wingless基因具有同源性、功能相似，故將二者名字合并得名為Wnt〔8〕。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分為經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路、Wnt/Ca2+信號(hào)通路、Wnt/平面細(xì)胞極性(PCP)信號(hào)通路。近年來(lái)，學(xué)者發(fā)現(xiàn)研究最多的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中起到重要的作用〔9，10〕，與膝骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞的分化、增殖和凋亡有關(guān)，此通路的異常會(huì)導(dǎo)致膝骨性關(guān)節(jié)炎的形成。

1.1經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的組成 經(jīng)典信號(hào)通路是由細(xì)胞外的信號(hào)蛋白、細(xì)胞膜上的跨膜受體、內(nèi)源性抑制劑、胞質(zhì)蛋白、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子、下游靶基因組成〔11〕。其中信號(hào)蛋白是Wnt蛋白家族，該蛋白是一類廣泛存在的分泌型糖蛋白，已發(fā)現(xiàn)有19個(gè)成員，其中Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a和Wnt10a等已被證實(shí)參與β-catenin上游基因激活經(jīng)典通路〔12～15〕；跨膜受體包括低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)5/6、卷曲蛋白(Fzd)；胞質(zhì)蛋白包括軸蛋白(Axin)、散亂蛋白(Dsh)、腺瘤性結(jié)腸息肉病基因(APC)、β-catenin、糖原合成酶激酶(GSK)-3β；核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子有T淋巴因子(TCF)和淋巴增強(qiáng)因子(LEF)；下游靶基因包括基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等。Wnt通路特異性抑制物有分泌性Dickkopf相關(guān)蛋白(DKK)-1、分泌型FZ相關(guān)蛋白(sFRP)、Wnt抑制因子(WIF)、硬化蛋白(SOST)等〔16〕，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的各靶點(diǎn)都至關(guān)重要，在生理調(diào)控方面起關(guān)鍵作用。

1.2經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo) Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一種進(jìn)化上保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，控制發(fā)育的多個(gè)方面，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞命運(yùn)決定、凋亡、細(xì)胞遷移和發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞極〔17〕。當(dāng)細(xì)胞外存在Wnt信號(hào)通路特異性抑制物(如DKK-1、SOST、WIF1、sFRP等)時(shí)，Wnt蛋白無(wú)法與受體Frz和輔助受體LRP5/6結(jié)合，APC、GSK-3β、Axin三者形成的降解復(fù)合物與細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin結(jié)合，該降解復(fù)合物上的GSK-3β可使β-catenin磷酸化后通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin水平顯著降低；當(dāng)不存在Wnt信號(hào)通路抑制物時(shí)，Wnt蛋白通過(guò)與膜上的跨膜受體Frz和LRP5/6結(jié)合，阻礙APC、GSK-3β和Axin三者形成降解復(fù)合物，從而抑制β-catenin的磷酸化，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集，當(dāng)達(dá)到一定量時(shí)，β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合，該復(fù)合物作為轉(zhuǎn)錄激活因子可引起經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的靶基因表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)控作用〔18〕。在正常機(jī)體內(nèi)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制和激活同時(shí)存在，維持動(dòng)態(tài)平衡，并與機(jī)體生長(zhǎng)狀態(tài)相適應(yīng)〔19〕。

2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路與膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨代謝

Wnt/β-catenin信號(hào)通路的傳導(dǎo)在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎期間調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化中起著重要作用〔20〕，該通路下游基因和蛋白表達(dá)可影響關(guān)節(jié)軟骨生長(zhǎng)代謝，與關(guān)節(jié)軟骨損傷相關(guān)〔21〕，這一經(jīng)典途徑的激活，已被認(rèn)為參與膝骨性關(guān)節(jié)炎的加重〔22〕。

2.1DKK-1 DKK是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的信號(hào)抑制劑，經(jīng)典的Wnt拮抗家族，可與跨膜受體LRP5/6結(jié)合，阻止細(xì)胞外Wnt蛋白的配體作用，從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)〔23〕。DKK-1是一種分泌性糖蛋白，是Wnt/β-catenin信號(hào)通路上游的主要抑制因子之一，可以抑制骨形成〔24〕。Oh等〔23〕觀察到無(wú)論是通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射表達(dá)DKK-1的腺病毒(AdDKK-1)還是在軟骨細(xì)胞特異性DKK-1轉(zhuǎn)基因小鼠的背景下，關(guān)節(jié)軟骨中DKK-1的過(guò)度表達(dá)對(duì)包括關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨贅形成和軟骨下骨硬化在內(nèi)的膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病都具有保護(hù)作用，且DKK-1的抑制作用與其抑制Wnt介導(dǎo)的分解代謝因子(如MMP-13)在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)能力有關(guān)。Sassi等〔10〕使用DKK-1處理的去分化人類關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞模型，研究結(jié)果顯示成纖維細(xì)胞樣形態(tài)出現(xiàn)延遲，表明DKK-1能起到抑制膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的作用。Funck-Brentano等〔25〕發(fā)現(xiàn)DKK-1可能通過(guò)介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制β-catenin移位進(jìn)入細(xì)胞核，控制軟骨下骨的激活，降低骨贅的破壞生成，導(dǎo)致膝骨性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度降低。

2.2Wnt3a Wnt蛋白是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的啟動(dòng)因子。Wnt信號(hào)的穩(wěn)態(tài)水平對(duì)干細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞分化和功能至關(guān)重要，該信號(hào)在膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)組織中上調(diào)，并驅(qū)動(dòng)骨分化、軟骨降解、軟骨細(xì)胞肥大和炎癥〔26〕。在哺乳動(dòng)物中，鑒定出19種Wnt蛋白，小鼠Wnt3a蛋白是第一個(gè)具有生化特性的蛋白〔10〕。Liu等〔27〕發(fā)現(xiàn)正常運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)膝骨性關(guān)節(jié)炎和損傷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，Wnt3a和β-catenin蛋白水平增加，Ⅱ型膠原減少。Wnt3a是Wnt/β-catenin信號(hào)通路典型的、特征良好的激活劑，在關(guān)節(jié)炎中有既定的作用，并且在關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)〔28〕。Thomas等〔29〕研究發(fā)現(xiàn)在Wnt3a刺激的軟骨細(xì)胞中分解代謝蛋白酶(MMP、ADAMTS-4和5)的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解；Wnt3a會(huì)誘導(dǎo)MMP13基因在小鼠原代軟骨細(xì)胞中快速表達(dá)，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎樣表型〔30〕；Lietman等〔31〕也發(fā)現(xiàn)Wnt3a略微增加了人軟骨細(xì)胞中MMP-13的表達(dá)。Bouaziz等〔32〕發(fā)現(xiàn)Wnt3a可通過(guò)增強(qiáng)β-catenin到細(xì)胞核中的易位來(lái)增加Wnt/β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，增強(qiáng)分解代謝物(ADAMTS-4和5、MMP3、MMP-13)的表達(dá)。

2.3β-catenin β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的核心元件〔33〕，在軟骨細(xì)胞的分化、成熟、凋亡中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞中β-catenin表達(dá)多少?zèng)Q定著經(jīng)典Wnt信號(hào)通路是否被激活〔34〕。Zhu等〔35〕發(fā)現(xiàn)成年小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中β-catenin的激活導(dǎo)致MMPs的明顯增加，引起ECM降解，軟骨細(xì)胞過(guò)早分化并發(fā)展成膝骨性關(guān)節(jié)炎樣表型。Zhou等〔36〕發(fā)現(xiàn)條件性激活β-catenin信號(hào)的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的軟骨變性、軟骨下骨侵蝕和骨贅形成。Held等〔37〕通過(guò)對(duì)β-catenin進(jìn)行染色，測(cè)試該蛋白是否作為典型Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的突出效應(yīng)器，實(shí)驗(yàn)觀察到隨著膝骨性關(guān)節(jié)炎分級(jí)的增加，β-catenin染色增加，這證實(shí)了人膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中典型Wnt信號(hào)的激活。Bouaziz等〔38〕發(fā)現(xiàn)阻斷β-catenin/TCF的相互作用，能夠減輕小鼠的膝骨性關(guān)節(jié)炎表型并下調(diào)MMP-13的表達(dá)。研究表明〔39，40〕，β-catenin缺失的軟骨細(xì)胞降低了骨保護(hù)素的表達(dá)或增加了核因子(NF)-κB配體的受體激活因子的活性，導(dǎo)致破骨細(xì)胞形成增加，小梁骨形成和重塑減少。

2.4MMP-13 MMPs是一種蛋白水解酶，是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因。在人類MMP家族中至少有26種類型的分子，與正常軟骨相比，MMP-1、MMP-3、MMP-13和MMP-28在膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，特別是MMP-13在軟骨破壞中發(fā)揮中心作用〔2〕。MMP-13是在對(duì)乳腺癌組織研究時(shí)被發(fā)現(xiàn)與鑒定出來(lái)的，其在正常組織中不表達(dá)，而在膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中有高表達(dá)〔41〕。MMPs主要參與膝骨性關(guān)節(jié)炎中ECM的分解，其表達(dá)增加與膝骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展密切相關(guān)，在這些MMPs中，MMP-13通過(guò)降解ECM被認(rèn)為在膝骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如Ⅱ型膠原的降解，這是ECM的主要組成成分〔42〕。Yuasa等〔43〕發(fā)現(xiàn)Wnt3a激活Wnt/β-catenin途徑后，兔關(guān)節(jié)軟骨中的MMP-3和MMP-13的基因表達(dá)增加。先前的一項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠中MMP-13的高表達(dá)水平可導(dǎo)致膝骨性關(guān)節(jié)炎樣病理改變的出現(xiàn)〔44〕，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在這一過(guò)程中起重要作用，β-catenin的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致MMP-13基因表達(dá)增加，從而導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解〔27〕。因此，抑制MMP-13的表達(dá)可能給予軟骨保護(hù)，這在膝骨性關(guān)節(jié)炎的治療中具有治療價(jià)值〔45〕。

3 中西醫(yī)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路與膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨代謝

Wnt/β-catenin信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)是調(diào)節(jié)膝骨性骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的獨(dú)特信號(hào)通路，參與了膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制〔46〕。越來(lái)越多的研究者通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，用不同的干預(yù)方法證實(shí)了Wnt/β-catenin通路與膝骨性關(guān)節(jié)炎有著特殊的聯(lián)系。

3.1中醫(yī)療法 顏春魯?shù)取?7〕研究發(fā)現(xiàn)大劑量右歸丸干預(yù)后，能夠有效促進(jìn)膝骨性關(guān)節(jié)炎模型組大鼠DKK-1mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制WISP1、Wnt1、β-catenin和LRP5 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，進(jìn)而推測(cè)右歸丸可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路起到治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的目的。還發(fā)現(xiàn)富硒黃芪皂苷的治療機(jī)制可能是通過(guò)升高DKK-1基因和蛋白的表達(dá)，降低WISP1、β-catenin、LRP5基因和蛋白的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的治療作用〔48〕。何曉娟等〔49〕研究結(jié)果顯示跳骨片治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎可能通過(guò)上調(diào)GSK-3β的表達(dá)、下調(diào)β-catenin、Frizzled-2的表達(dá)，調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，達(dá)到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。Zhong等〔50〕發(fā)現(xiàn)青蒿素通過(guò)抑制白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α和MMP-13等促炎趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，在IL-1β誘導(dǎo)的大鼠OA軟骨細(xì)胞和OA患者來(lái)源的細(xì)胞中顯示出強(qiáng)大的抗炎作用。鄺高艷等〔51〕研究發(fā)現(xiàn)加味獨(dú)活寄生合劑治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制可能與調(diào)控Wnt信號(hào)通路有關(guān)，通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕疼痛，改善膝骨關(guān)節(jié)功能。馬勇等〔52〕研究初步證明了姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用是通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而促進(jìn)正常軟骨細(xì)胞增殖，中藥姜黃具有抗骨關(guān)節(jié)炎作用，是因?yàn)榻S素是有效成分之一。張媛媛等〔53〕通過(guò)電針“內(nèi)膝眼”“犢鼻”可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低下游靶基因MMP-13的表達(dá)，從而抑制軟骨基質(zhì)的降解和軟骨細(xì)胞的凋亡，起到延緩膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展進(jìn)程的作用。周偉等〔54〕在對(duì)活血膏作用于膝骨性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制探討中發(fā)現(xiàn)膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病后的確存在Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活，抑制該通路過(guò)表達(dá)是治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵，發(fā)現(xiàn)活血膏可明顯抑制這一過(guò)程。

3.2西醫(yī)療法 Yu等〔55〕發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛，抑制OA患者的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，該信號(hào)通路途徑的調(diào)節(jié)在辛伐他汀誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)中起重要作用。Xu等〔56〕通過(guò)研究首次證明聚半乳酸通過(guò)抑制Wnt/β-catenin和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路抑制大鼠軟骨細(xì)胞MMPs的表達(dá)和軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，表明聚半乳酸可以作為OA的治療劑。姜鵬等〔57〕研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔注射臭氧后膝關(guān)節(jié)軟骨β-catenin和MMP-13表達(dá)降低，臭氧可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎。吳小川〔58〕探討阿侖膦酸鈉治療膝骨性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin可與骨保護(hù)素(OPG)/NF-κB受體活化因子(RANK)/RANK配體(RANKL)等信號(hào)通路共同作用于軟骨細(xì)胞軟骨下骨，并影響下游MMP-13、β-catenin及Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)，起到治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的作用。

綜上，近年來(lái)，學(xué)者們主要著眼于細(xì)胞因子水平的研究，調(diào)控內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的眾多信號(hào)通路成為研究的熱點(diǎn)，炎癥介質(zhì)、生長(zhǎng)因子和不同的信號(hào)通路可能同時(shí)參與了這個(gè)過(guò)程并相互影響，如Wnt、NF-κB、MAPK、OPG/RANK/RANKL、Notch等信號(hào)通路〔59，60〕與膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病關(guān)系均可查到相關(guān)文獻(xiàn)，為進(jìn)一步闡明膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。開(kāi)發(fā)選擇性地針對(duì)該途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子，作為治療膝骨性關(guān)節(jié)炎等許多骨疾病的新治療方式的基礎(chǔ)療法似乎具有很大潛力，并且在這方面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。雖然動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)于闡明Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)軟骨生物學(xué)和病理學(xué)的細(xì)胞和分子機(jī)制至關(guān)重要，但人類生物學(xué)方面的多樣性和復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他生物，人類是高級(jí)生物，因此，我們不應(yīng)該高估動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)該謹(jǐn)慎地將這些發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于人類。我們已經(jīng)了解到該途徑在骨生物學(xué)的許多方面發(fā)揮的核心作用，但還需要更細(xì)致的了解Wnt/β-catenin信號(hào)通路在生理和病理環(huán)境下是如何運(yùn)作的，才能尋找出該通路上最有效增強(qiáng)劑或抑制劑來(lái)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎。