邊東生，徐紅蕊

（1.南陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 南陽(yáng) 473000；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院）

很多檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)人員認(rèn)為，熒光定量PCR 是一項(xiàng)非常簡(jiǎn)單的檢測(cè)工作，檢驗(yàn)檢測(cè)人員只要將樣品采集完畢，送往實(shí)驗(yàn)室處理好，加樣品，上機(jī)器，等時(shí)間，出結(jié)果就可以了，但事實(shí)并非如我們想象的那么簡(jiǎn)單。雖然檢測(cè)人員把試驗(yàn)做了，但是檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性是不敢保證的。實(shí)踐證明，一個(gè)準(zhǔn)確的檢測(cè)需要注意的事項(xiàng)和細(xì)節(jié)非常多，下面筆者就樣品采集、實(shí)驗(yàn)室操作和常見(jiàn)問(wèn)題分析三大項(xiàng)進(jìn)行詳細(xì)敘述。

1 樣品采集

能做非洲豬瘟檢測(cè)的樣品有很多，如唾液樣本、抗凝血、血清、淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體、肺臟、肝臟、腎臟、棉拭子、糞便、流產(chǎn)胎兒等，采集不同的樣品，其處理方式方法也不一樣，如唾液樣品在采集完后最好在2～3 h 內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室，如果不能保證時(shí)間，最好將唾液樣本放在唾液保存液中送檢。如果沒(méi)有唾液保存液，送往實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間又特別長(zhǎng)，這樣會(huì)對(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果有很大影響。因?yàn)橥僖褐杏泻芏嗝割?，很容易降解唾液?dāng)中的病毒核酸。除了唾液外，血清樣本也是常用于做非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)的，短時(shí)間內(nèi)可做檢測(cè)的血清樣本常放在4 ℃保存，長(zhǎng)時(shí)不做則要放在-20 ℃保存。但是如果樣品是抗凝血，則不能凍存，這里要注意的是抗凝管不能選擇肝素鈉，因?yàn)楦嗡剽c對(duì)于熒光PCR 反應(yīng)當(dāng)中所使用的酶有較大的抑制作用，檢測(cè)結(jié)果容易出現(xiàn)假陰性。如果是組織樣品，短期內(nèi)放在4 ℃，長(zhǎng)期的則放在-70 ℃即可，如果實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有低溫冰箱，放在-20 ℃也是可以的。

采集完樣品后，樣品是否合格也是有依據(jù)的。以血清樣品為例，樣品量較少，樣品膠凍樣、發(fā)生溶血等均為不合格樣品。合格的血清一般是均一的，離心后呈淡黃色或者無(wú)色。在檢測(cè)當(dāng)中常見(jiàn)的不合格樣品就是溶血樣品，眾所周知，溶血是因?yàn)榧t細(xì)胞發(fā)生破裂導(dǎo)致的血紅蛋白滲出。導(dǎo)致溶血的兩個(gè)重要因素是采集完全血后運(yùn)輸途中發(fā)生了劇烈的機(jī)械性震動(dòng)和離心過(guò)程中設(shè)置的轉(zhuǎn)速過(guò)高。因此，為了避免溶血，筆者建議在采集完血液后最好放在室溫靜置半小時(shí)再離心，離心轉(zhuǎn)速不得超過(guò)5 000 轉(zhuǎn)每分鐘，或者放入冰箱保存，這樣既不會(huì)出現(xiàn)溶血，也不會(huì)出現(xiàn)膠凍。

2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.1 檢測(cè)方法

從實(shí)驗(yàn)方法上看，非洲豬瘟檢測(cè)方法有很多，如熒光定量PCR、PCR、ELISA、DNA原位雜交、免疫組織化學(xué)、病毒分離鑒定、動(dòng)物接種試驗(yàn)等，另外，還有一些新的檢測(cè)方法如膠體金免疫層析試紙條、化學(xué)發(fā)光技術(shù)等。雖然檢測(cè)方法有很多，但是從生產(chǎn)實(shí)際來(lái)看，應(yīng)用最多的還是熒光定量PCR 技術(shù)和ELISA 方法，這兩種檢測(cè)方法并不是孤立存在的，而是配合完成非洲豬瘟陽(yáng)性場(chǎng)的拔點(diǎn)滅源工作的。因?yàn)樵诟腥镜脑缙冢侵挢i瘟病毒在豬體內(nèi)復(fù)制，并被釋放出來(lái)，此時(shí)的豬唾液、血清中是有很多病毒顆粒的，應(yīng)用熒光PCR檢測(cè)方法很容易檢測(cè)出來(lái)，但是到了感染的后期，血清中抗體水平就上來(lái)了，病毒顆粒就沒(méi)有那么多了，用ELISA 檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)候就會(huì)很容易檢測(cè)出來(lái)，但是熒光PCR 檢測(cè)的時(shí)候容易出現(xiàn)假陰性。因此，這兩種方法要結(jié)合使用才能更好地指導(dǎo)生產(chǎn)。

2.2 檢測(cè)結(jié)果判定

在對(duì)熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定的時(shí)候，不能單純地只看機(jī)器給出的結(jié)果，還要單獨(dú)分析真實(shí)曲線擴(kuò)增情況。主要從以下流程進(jìn)行分析。第一步是查看整體擴(kuò)增曲線，尤其是線性和對(duì)數(shù)曲線是否正常。第二步是查看陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，看看是否正常。第三步是查看被檢測(cè)的樣品擴(kuò)增曲線是否正常。第四步是根據(jù)擴(kuò)增情況查看是否需要調(diào)整閾值線高度。第五步是根據(jù)擴(kuò)增情況查看是否需要調(diào)整基線范圍。

2.3 檢測(cè)結(jié)果考評(píng)

針對(duì)檢測(cè)結(jié)果的考評(píng)主要從以下三方面著手，一是查看擴(kuò)增曲線是否為明顯的“S”形擴(kuò)增曲線，即擴(kuò)增曲線是否有指數(shù)擴(kuò)增期。二是陽(yáng)性對(duì)照的CT值是否在預(yù)期范圍內(nèi)，如果陽(yáng)性對(duì)照過(guò)早出現(xiàn)，則很可能是陽(yáng)性對(duì)照被污染或者加樣的時(shí)候加錯(cuò)了。如果陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)過(guò)晚，則很可能體系內(nèi)有抑制因素存在或者操作過(guò)程有誤。三是查看陰性對(duì)照是否報(bào)告CT 值，如果陰性對(duì)照有CT 值，則表明擴(kuò)增體系被污染，如果無(wú)擴(kuò)增曲線，則主要是閾值線過(guò)低導(dǎo)致。

2.4 注意事項(xiàng)

筆者認(rèn)為，非洲豬瘟檢測(cè)當(dāng)中，要注意以下四點(diǎn)，一是在整個(gè)檢測(cè)中要全程使用濾芯滴頭。二是標(biāo)陰、標(biāo)陽(yáng)樣品必須進(jìn)行明確標(biāo)注。三是檢測(cè)后如果出現(xiàn)疑似陽(yáng)性樣品，必須進(jìn)行復(fù)檢。四是整個(gè)過(guò)程中可能污染或者存在散毒風(fēng)險(xiǎn)的樣品、試劑、廢棄物要進(jìn)行高壓滅菌。但要注意的是擴(kuò)增過(guò)的PCR 管是不能高壓滅菌的，因?yàn)镻CR 管中存在有大量的PCR 產(chǎn)物，一旦PCR 管在高壓過(guò)程中出現(xiàn)破裂，那些陽(yáng)性對(duì)照或者陽(yáng)性樣品就會(huì)四處擴(kuò)散，污染整個(gè)實(shí)驗(yàn)室。

3 熒光PCR檢測(cè)常見(jiàn)問(wèn)題及分析

3.1 無(wú)擴(kuò)增曲線或者無(wú)CT值

當(dāng)檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)無(wú)擴(kuò)增曲線或者無(wú)CT 值的時(shí)候，要從以下五個(gè)方面進(jìn)行分析，第一是軟件設(shè)置是否有誤，如信號(hào)采集設(shè)置、熒光通道設(shè)置是否設(shè)置正確。一些國(guó)產(chǎn)的熒光PCR 儀通常淬滅基團(tuán)默認(rèn)的是“None”，但是進(jìn)口的熒光PCR 儀的淬滅基團(tuán)通常需要手動(dòng)選擇。如果信號(hào)采集、熒光通道、淬滅基團(tuán)都沒(méi)有問(wèn)題，那就接著往下找原因。第二是儀器硬件故障。如熒光采集、溫控系統(tǒng)等是否出現(xiàn)了故障。第三是檢測(cè)試劑的問(wèn)題。如引物或者探針是否降解、酶是否失活。第四是核酸提取的問(wèn)題。如核酸提取失敗或者模板錯(cuò)誤、漏加。這些也會(huì)造成沒(méi)有擴(kuò)增曲線或者無(wú)CT 值。第五是核酸樣本中存在抑制物。樣本中PCR 反應(yīng)抑制物可以分為兩類，一類是內(nèi)源性的，如血紅蛋白、脂類、蛋白、多糖等。還有一類是外源性的抑制物，如肝素、抗凝劑、乙醇、胍鹽等。

3.2 陰性對(duì)照有擴(kuò)增

陰性對(duì)照有擴(kuò)增通常有三種情況，第一種是陰性對(duì)照有較小的擴(kuò)增，第二種是陰性對(duì)照有較大的擴(kuò)增，第三種是陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照一樣。這三種情況也間接說(shuō)明了污染從輕到重的一個(gè)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)室污染的來(lái)源有很多，如擴(kuò)增產(chǎn)物的污染、檢測(cè)樣本之間的交叉污染、檢測(cè)試劑的污染、氣溶膠的污染等。要知道，污染比較頑固的，不易去除，尤其是氣溶膠污染實(shí)驗(yàn)室，短時(shí)間內(nèi)很難去除。因此，在操作過(guò)程中，檢驗(yàn)檢測(cè)人員不能存在僥幸的心理，要有較強(qiáng)的防污染意識(shí)和較標(biāo)準(zhǔn)的操作要求。另外，實(shí)驗(yàn)室要有嚴(yán)格的功能區(qū)劃分，在檢測(cè)過(guò)程中要設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照。如果實(shí)驗(yàn)室不小心被污染了，要怎么去處理污染？筆者認(rèn)為可以用以下方法進(jìn)行：如實(shí)驗(yàn)室保持通風(fēng)，最好有機(jī)械通風(fēng)設(shè)備；使用核酸清除劑進(jìn)行噴灑和擦拭；10%次氯酸鈉噴灑或擦拭；1 mol/L 的鹽酸溶液浸泡；紫外線照射；無(wú)水乙醇噴霧或者75%乙醇清洗。

3.3 同一樣本檢測(cè)重復(fù)性不好

檢測(cè)重復(fù)性不好的主要原因有以下四個(gè)方面。一是實(shí)驗(yàn)室操作過(guò)程中加樣不準(zhǔn)確，移液器準(zhǔn)確度有爭(zhēng)議。這種問(wèn)題可在試驗(yàn)前先對(duì)移液器進(jìn)行校準(zhǔn)，然后再做檢測(cè)。二是儀器硬件的因素，如孔與孔之間的溫度差異。三是模板濃度過(guò)低，泊松分布導(dǎo)致孔間樣本量差異較大，其是對(duì)于弱陽(yáng)性樣本，每個(gè)試劑盒廠家都不敢百分之百保證每次都能檢測(cè)出陽(yáng)性，這很可能是泊松分布造成的。四是熒光PCR反應(yīng)管均一性較差，也會(huì)造成孔與孔之間的重復(fù)性不好，這可以通過(guò)耗材之間的驗(yàn)證選擇重復(fù)性較好的耗材即可。

3.4 異常的擴(kuò)增曲線

出現(xiàn)異常擴(kuò)增曲線的主要原因有以下四個(gè)方面，一是擴(kuò)增體系內(nèi)有抑制因素。擴(kuò)增體系內(nèi)有抑制因素，擴(kuò)增曲線就會(huì)出現(xiàn)異常走勢(shì)。二是擴(kuò)增反應(yīng)管密閉不嚴(yán)，反應(yīng)液揮發(fā)，擴(kuò)增曲線出現(xiàn)異常也是比較常見(jiàn)的因素。三是儀器硬件故障。目前市場(chǎng)上大部分實(shí)驗(yàn)室都存在國(guó)產(chǎn)的熒光PCR儀，國(guó)產(chǎn)的熒光PCR儀配件容易老化，尤其是金屬鎢燈老化很快，熒光PCR儀電壓也不穩(wěn)，很容易造成擴(kuò)增曲線異常的現(xiàn)象。在更換金屬鎢燈之后，擴(kuò)增曲線很快就變得正常起來(lái)。四是基線范圍設(shè)之不當(dāng)?；€設(shè)置過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)影響樣本檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.5 本底較高或者閾值線較低出現(xiàn)CT值

本底較高，陰性樣本出現(xiàn)CT 值這種情況也是比較常見(jiàn)的，如果是本底較高導(dǎo)致的樣本出現(xiàn)CT值，我們就要先看一下樣本的擴(kuò)增曲線，如果樣本的擴(kuò)增曲線是“S”形，則樣本為陽(yáng)性，如果樣本的擴(kuò)增曲線沒(méi)有“S”形，那么這些樣本就是陰性。閾值線較低也會(huì)出現(xiàn)CT 值，這主要是閾值線設(shè)置過(guò)低，造成閾值線與擴(kuò)增曲線有交叉點(diǎn)，才出現(xiàn)CT值。針對(duì)這種現(xiàn)象，我們只需要針對(duì)閾值線稍做調(diào)整即可。□