錢地坤綜述 吳術(shù)紅審校

1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563006；

2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，貴州 遵義 563003

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種擁有強(qiáng)多分化能力的細(xì)胞集群，它們具有長(zhǎng)期活性以及自我更新能力，可以經(jīng)由炎癥因子、細(xì)胞因子、多肽及物理刺激的誘導(dǎo)生成軟骨、骨骼、肌肉、肌腱、韌帶和脂肪等多系細(xì)胞，因此在組織修復(fù)治療的研究中成為了新型熱點(diǎn)[1]。隨著對(duì)MSCs的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)MSCs具有三個(gè)特別屬性：(1)具備分化成多種細(xì)胞系的能力；(2)具備獨(dú)特的低免疫原性及免疫抑制能力；(3)可以分泌與接受一些可調(diào)節(jié)性的關(guān)鍵生物學(xué)功能因子，并誘導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞增殖和分化[2]?，F(xiàn)今的研究進(jìn)展已證實(shí)許多生長(zhǎng)因子在韌帶損傷的修復(fù)過(guò)程中可顯著調(diào)節(jié)和改善MSCs的分化增殖能力[3]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、骨形成蛋白1(BMP-1)、骨形成蛋白2(BMP-2)、白介素IL-17A、白介素IL-17F、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、富血小板纖維蛋白(PRF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和細(xì)胞外基質(zhì)均起到促進(jìn)MSCs分化增殖的作用，而環(huán)氧化酶-2(COX-2)與白介素IL-1β則對(duì)MSCs有抑制功能[4]。隨著社會(huì)發(fā)展及醫(yī)療需求，深入開發(fā)利用間充質(zhì)干細(xì)胞的多向潛力來(lái)促進(jìn)骨骼再生、修復(fù)韌帶和肌腱損傷已經(jīng)成為一項(xiàng)迫切的任務(wù)。結(jié)合基因治療和組織工程的快速進(jìn)步，它們有可能大幅提高患者的早期康復(fù)程度，減少康復(fù)時(shí)間和提升生活質(zhì)量。

骨關(guān)節(jié)外科中的肌腱和韌帶損傷很常見，韌帶本身的強(qiáng)度與膠原纖維的數(shù)量和大小有關(guān)，而膠原纖維在發(fā)育過(guò)程中會(huì)隨著身體需求或發(fā)育而增加，但隨著年齡的增加，膠原纖維的生成速度也隨之減緩，因此一旦韌帶遭受損傷，修復(fù)通常比較緩慢，整個(gè)治療過(guò)程也較復(fù)雜與漫長(zhǎng)[5]。即使韌帶得到修復(fù)，創(chuàng)傷后愈合的韌帶組織的生化和機(jī)械特性永遠(yuǎn)無(wú)法完整恢復(fù)至未損傷時(shí)的狀態(tài)。隨著醫(yī)療服務(wù)水平的提升和患者生活需求的不斷增加，為了使患者更快地從韌帶損傷中康復(fù)，相關(guān)科研人員正在不斷探索新的治療方案[6]。細(xì)胞學(xué)組織工程的飛速發(fā)展為之提供了一些方案，MSCs的出現(xiàn)給韌帶快速修復(fù)提供了新的可能，MSCs已證明具有自我更新和多向分化潛能的能力，在這基礎(chǔ)上給予MSCs正確且適當(dāng)?shù)姆只h(huán)境，就可以改善韌帶組織的修復(fù)和再生效率[7]。本綜述評(píng)估了用于韌帶組織修復(fù)的間充質(zhì)干細(xì)胞向韌帶成纖維細(xì)胞定向分化的相關(guān)研究，并進(jìn)一步探討了該方向的前沿性與實(shí)用性。

1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)在韌帶組織修復(fù)中的應(yīng)用

人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞是MSCs家族中分化能力較強(qiáng)的一類，除繼承了MSCs的生物學(xué)特點(diǎn)之外，還可經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)后大幅度上調(diào)韌帶特異性基因的表達(dá)，提高韌帶特異性蛋白的合成率，因此，它已成為韌帶組織工程種子細(xì)胞的重要來(lái)源之一[8]。在hAMSCs體外誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，其高度相關(guān)的基因?yàn)轫g帶成纖維細(xì)胞相關(guān)基因和血管生成相關(guān)基因，因此可以增強(qiáng)韌帶成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白的合成，并加速微血管的再生，加快韌帶修復(fù)速度[9]。hAMSCs可從胎盤中大量獲得，且它們的提取不會(huì)對(duì)患者本身造成任何創(chuàng)傷，也不受到明顯的倫理或道德限制[10]。在相關(guān)研究中，hAMSCs顯示出對(duì)白細(xì)胞共同抗原CD45和人白細(xì)胞DR抗原(HLA-DR)的低表達(dá)，這證明了hAMSCs具有低免疫原性，大幅度降低了免疫反應(yīng)，提升了應(yīng)用安全程度[11]，因此，hAMSCs可以成為修復(fù)組織或器官損傷而不引起免疫排斥的細(xì)胞資源。此外，該研究發(fā)現(xiàn)在bFGF和TGF-β1誘導(dǎo)聯(lián)合Transwell共培養(yǎng)條件下，hAMSCs分化為人前交叉韌帶成纖維細(xì)胞(hACLFs)最為成功，其過(guò)程中細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，韌帶修復(fù)相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)的mRNA表達(dá)也顯著上調(diào)。ZHANG等[12]發(fā)現(xiàn)經(jīng)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(FGF-2)誘導(dǎo)后的hAMSCs能促進(jìn)膠原纖維形成，進(jìn)而加速韌帶愈合，同時(shí)FGF-2在發(fā)揮功能時(shí)還可能同步激活其他重要因素的釋放，從而加速腱到骨的愈合，但其詳細(xì)機(jī)制目前尚未明朗，仍需要進(jìn)一步研究探索。Scleraxis基因是至今鑒定的唯一直接調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的因子，它是一個(gè)堿性螺旋環(huán)螺旋(basic helix-loop-helix，bLHL)轉(zhuǎn)錄因子，在肌腱和韌帶的祖細(xì)胞以及這些韌帶的分化細(xì)胞中表達(dá)，可以促進(jìn)腱細(xì)胞分化和成熟以及肌腱形成[13]。桑鵬等[14]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Scleraxis基因和bFGF聯(lián)合作用后，可大幅促進(jìn)hAMSCs向人韌帶成纖維細(xì)胞分化，這為韌帶損傷修復(fù)治療提供了新的思路。而鄒剛等[15]通過(guò)試驗(yàn)也同樣證明了在Scleraxis基因協(xié)同誘導(dǎo)hAMSCs成韌帶分化的過(guò)程中，人脫細(xì)胞羊膜支架貢獻(xiàn)了積極的調(diào)控作用。湯井灃[16]的論文中闡述了選取9:1納米纖維膜制備的hAMSCs/PVA/CS納米纖維生物膜在bFGF和TGF-β1的共同作用下，增強(qiáng)了兔髕韌帶損傷的修復(fù)能力，但該結(jié)果只限于動(dòng)物，還未聯(lián)合臨床實(shí)驗(yàn)，因此仍有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。而李豫皖等[10]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)合使用bFGF和TGF-β1可提升hAMSCs向hACLFs分化的效率及誘導(dǎo)效果。

hAMSCs作為間充質(zhì)干細(xì)胞家族的一員，標(biāo)志性的特點(diǎn)就是其較強(qiáng)的分化及組織修復(fù)能力。在向韌帶組織分化過(guò)程的基因調(diào)控中，高親和的韌帶成纖維細(xì)胞相關(guān)基因和血管生成相關(guān)基因發(fā)揮主要作用。Scleraxis基因是標(biāo)志性的一種成韌帶向調(diào)控基因，其在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，同時(shí)與bFGF聯(lián)合作用，提升分化能力；此外在膠原蛋白的產(chǎn)生調(diào)控中，F(xiàn)GF-2可促使膠原纖維生成；分化后期在TGF-β1的作用下hAMSCs的增殖能力進(jìn)一步得到提升。但hAMSCs的免疫抑制功能研究較少，且所抑制的白細(xì)胞共同抗原種類也偏少，這與其他種類的間充質(zhì)干細(xì)胞存在一定的差異，有進(jìn)一步深入研究的價(jià)值；此外關(guān)于該分化過(guò)程中的信號(hào)分子通路尚不清楚。

綜上所述，在近5年的hAMSCs向韌帶組織分化的研究中，多篇文章均已證明該細(xì)胞種類的高度實(shí)用性，且通過(guò)bFGF和TGF-β1與多種材料支架或輔助膜的聯(lián)合作用下，hAMSCs可顯著分化為韌帶組織，加速韌帶的恢復(fù)愈合，并可在一定程度下分化為hACLFs。

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在韌帶組織修復(fù)中的應(yīng)用

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向肌肉、骨組織多向分化潛能，是第一類被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行臨床使用的細(xì)胞，現(xiàn)已被應(yīng)用于多種軟組織損傷的修復(fù)，然而，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞分化的相關(guān)研究報(bào)道較少。2013年孫芳菲[17]便進(jìn)行了該類細(xì)胞的研究，該實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用TGF-β1和bFGF誘導(dǎo)兔的BMSCs定向分化為韌帶組織類細(xì)胞，之后把誘導(dǎo)后兔BMSCs移植于脫細(xì)胞真皮支架進(jìn)一步培養(yǎng)，完成目標(biāo)組織工程韌帶的構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法能顯著促使兔BMSCs定向轉(zhuǎn)化為韌帶組織類細(xì)胞，并能在脫細(xì)胞真皮支架材料上生長(zhǎng)增殖，同時(shí)，該細(xì)胞的膠原蛋白分泌能力得到提升。張亞強(qiáng)等[18]經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明調(diào)控BMSCs向韌帶系分化的早期細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)信號(hào)之一可能是細(xì)胞骨架的變化，因此他進(jìn)行單軸拉伸聯(lián)合定向的納米纖維誘導(dǎo)BMSCs分化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中BMSCs的分化程度得到一定的提升，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了通過(guò)體外小幅度低頻率周期性單軸拉伸刺激聯(lián)合定向納米支架能促進(jìn)BMSCs向韌帶方向分化，局部黏著斑激酶(FAK)和Rho激酶(ROCK)可能參與此過(guò)程，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。周盛源等[19]實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)染bFGF基因的BMSCs能明顯促進(jìn)韌帶分化，加速損傷愈合，并增加韌帶愈合強(qiáng)度。朱樂(lè)全等[20]發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)可通過(guò)纖維蛋白的作用明顯增強(qiáng)BMSCs的韌帶分化，提升前交叉韌帶重建效果。楊繼祥等[21]發(fā)現(xiàn)BMSCs附著蠶絲韌帶上進(jìn)行韌帶修復(fù)時(shí)，可以在一定程度上向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并使人工韌帶中的纖維組織及血管再生能力得到提升，總體促進(jìn)了韌帶的愈合。LUI等[22]證明低氧培養(yǎng)條件下可增強(qiáng)BMSCs中成纖維細(xì)胞方向基因的表達(dá)。另一篇研究也說(shuō)明，在機(jī)械拉伸刺激下，可能會(huì)促進(jìn)生腱蛋白-C的合成和BMSCs向盆腔韌帶成纖維細(xì)胞的分化[23]。WANG等[24]表明，上調(diào)新西蘭大白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)可以通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)ACL重建后的腱骨愈合。BI等[25]證明BMSCs聯(lián)合絲膠原支架進(jìn)行重建手術(shù)后，韌帶再生能力得到提升，移植骨愈合能力也得到提高。ZHAO等[26]進(jìn)行了相關(guān)研究，該研究中闡述了過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)與BMSCs的作用關(guān)系，PPAR-γ是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，在BMSCs分化為成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，PPAR-γ表達(dá)降低，而添加TGF-β1后PPAR-γ被抑制，同時(shí)BMSCs的分化能力提升，但過(guò)表達(dá)PPAR-γ后又抑制了BMSCs分化。這些結(jié)果表明PPAR-γ負(fù)向調(diào)節(jié)BMSCs向成纖維細(xì)胞的分化。此外關(guān)于PRP的研究中也說(shuō)明BMSCs和PRP共同作用后可顯著促進(jìn)同種異體肌腱及韌帶組織的成熟和修復(fù)[27]。SETIAWATI等[28]研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)行前交叉韌帶(ACL)重建時(shí)，使用BMSCs和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF聯(lián)合植入可促進(jìn)BMSCs分化成ACL。

與hAMSCs相似的是，TGF和bFGF對(duì)BMSCs同樣產(chǎn)生明顯的誘導(dǎo)分化作用，作用過(guò)程可能相似；此外BMP-2、VEGF和PRP的生長(zhǎng)因子均可以輔助促進(jìn)韌帶的分化，但機(jī)制尚不明確；比較要著重說(shuō)明的是，BMSCs對(duì)于物理刺激比較敏感，低氧環(huán)境、拉伸刺激以及支架附著的條件可大幅促進(jìn)分化能力；在受體水平中，PPAR-γ被發(fā)現(xiàn)可以負(fù)向控制BMSCs的分化能力，但同樣，分子通路水平中的研究目前仍不明確。

綜上所述，BMSCs作為最先進(jìn)行組織修復(fù)研究的一類細(xì)胞，在向韌帶組織分化中仍具有較強(qiáng)優(yōu)勢(shì)，從TGF-β1、bFGF、VEGF、PPAR-γ和BMP-2作用到物理刺激，以及多種支架的輔助研究種可以看出，BMSCs具有明顯的韌帶成纖維細(xì)胞分化能力，而且對(duì)多種因素的結(jié)合有較敏感的反應(yīng)。

3 其他種類間充質(zhì)干細(xì)胞在韌帶組織修復(fù)中的應(yīng)用

3.1 ACL來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ACL-MSCs)在韌帶組織修復(fù)中的應(yīng)用ACL生長(zhǎng)衍生的MSCs可具有分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的潛力，實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其在體外韌帶發(fā)生試驗(yàn)中顯示出自我更新的能力[29]。因此，使用ACL衍生來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞用于ACL損傷的再生治療顯得很有吸引力。然而，ACL-MSCs在體外增殖次數(shù)有限，有研究發(fā)現(xiàn)可通過(guò)使用編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)來(lái)減少該類細(xì)胞衰老的趨勢(shì)，增多其增殖次數(shù)，使其在韌帶修復(fù)過(guò)程中保持高度活躍，此外還可以對(duì)創(chuàng)造細(xì)胞系進(jìn)行詳細(xì)研究[30]。FU等[31]通過(guò)白細(xì)胞共同抗原CD73和CD90的組合標(biāo)記進(jìn)一步證明ACL的殘端可進(jìn)行原位衍生至干細(xì)胞，而實(shí)驗(yàn)證明這些衍生干細(xì)胞具有分化成韌帶譜系和間充質(zhì)譜系的能力。來(lái)自ACL殘余物的MSCs可能是用于韌帶再生的種子細(xì)胞的潛在來(lái)源。OGATA等[32]證明ACL衍生的MSCs具有高度分化為韌帶細(xì)胞的傾向，因此可能有助于韌帶再生，這些發(fā)現(xiàn)為可用于修復(fù)ACL組織的潛在干細(xì)胞療法提供了重要見解。TANG等[33]進(jìn)行了材料相關(guān)研究，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雙相電紡支架具有與ACL相似的機(jī)械性能和降解性。雙相電紡支架為致密的膠原結(jié)構(gòu)，而且在取向階段的膠原方向差異極小。將雙相電紡支架與MSCs結(jié)合后發(fā)現(xiàn)，該支架促進(jìn)了MSCs增殖發(fā)育，并可誘導(dǎo)MSCs向成纖維細(xì)胞分化，之后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步表明韌帶組織再生能力得到增強(qiáng)。ACL-MSCs作為衍生細(xì)胞來(lái)源，基因?qū)用娴念愅雀?，更易于誘導(dǎo)為ACL進(jìn)行臨床治療。但影響該細(xì)胞分化的基因及分子因素和免疫抗性尚不清楚，能確定的是，該細(xì)胞的分化傾向明確，特性較為活躍，可以被多次增殖，長(zhǎng)期培養(yǎng)并可以通過(guò)輔助支架進(jìn)行臨床治療，這為臨床治療ACL損傷提供了新的方向。

3.2 人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hEMSCs)在韌帶組織修復(fù)中的應(yīng)用子宮內(nèi)膜擁有較強(qiáng)的再生能力，而子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(endometrium mesenchymal stem cell，EMSC)在子宮內(nèi)膜干細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)后迅速的登上醫(yī)療修復(fù)領(lǐng)域的舞臺(tái)[34]，因其來(lái)源廣泛和較強(qiáng)的分化能力，一些研究者開始嘗試誘導(dǎo)其向韌帶成纖維細(xì)胞方向分化。袁瑞利等[35]進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)人hEMSCs可促進(jìn)大鼠子宮韌帶的損傷修復(fù)，在彈性蛋白水平的觀察中發(fā)現(xiàn)，彈性蛋白在干細(xì)胞組中的表達(dá)明顯高于瘢痕組，說(shuō)明在組織損傷修復(fù)過(guò)程中，hEMSCs可能向成纖維細(xì)胞分化或通過(guò)其他途徑，如外泌體、旁分泌作用等促進(jìn)彈性蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步組裝成成熟的彈性纖維，發(fā)揮其彈性作用，這也為減少組織的瘢痕生成或祛除疤痕等方向的治療提供新的指導(dǎo)方向。王玲玲等[36]研究發(fā)現(xiàn)hEMSCs在受損韌帶中可以向成纖維細(xì)胞分化，并主動(dòng)合成脂肪氧化酶(LOX)和細(xì)胞外基腩蛋白Fibulin家族第5成員(Fibulin-5)來(lái)促進(jìn)大鼠受損韌帶修復(fù)，減少瘢痕的形成，改善受損韌帶在維持彈力方面的能力。hEMSCs在韌帶修復(fù)領(lǐng)域的研究還比較少，現(xiàn)今仍處于分子與蛋白層面，目前確定能增強(qiáng)其能力的相關(guān)因素是LOX與Fibulin-5，外泌體也可能參與其中，具體的機(jī)制尚不明確，但其強(qiáng)大的分化潛力值得研究者去進(jìn)一步挖掘。

4 結(jié)語(yǔ)

在關(guān)于韌帶組織相關(guān)的MSCs的分化誘導(dǎo)中，有四種MSCs被發(fā)現(xiàn)存在明顯的成纖維細(xì)胞方向的誘導(dǎo)性，分別是人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、前交叉韌帶衍生來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞以及人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞。其中人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞有著最為顯著的分化特性，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力較強(qiáng)，且更容易接受多種生物性因子的誘導(dǎo)，前交叉韌帶衍生來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞更適用于進(jìn)行前交叉韌帶這類強(qiáng)度韌帶的治療，人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞還屬于研究進(jìn)程中，但對(duì)其未來(lái)前景應(yīng)抱有一定期待。

但對(duì)于這四種MSCs的實(shí)用性，仍存在一些問(wèn)題：(1)被誘導(dǎo)后，基因?qū)用媸欠駮?huì)存在某些突變；(2)是否存在化生的可能；(3)被誘導(dǎo)分化成韌帶后，在無(wú)支架的輔助下是否可以維持原有韌帶細(xì)胞平行性排列，或細(xì)胞間連接是否存在問(wèn)題；(4)韌帶內(nèi)部血運(yùn)情況是否受到影響，再生的韌帶內(nèi)部微循環(huán)系統(tǒng)與原來(lái)的組織有無(wú)差別；(5)再生韌帶內(nèi)部的神經(jīng)愈合情況如何。這些問(wèn)題需要進(jìn)一步研究，現(xiàn)在可以確定的是，MSCs向韌帶成纖維細(xì)胞分化的能力是存在且可調(diào)控的，可充分地填補(bǔ)韌帶修復(fù)領(lǐng)域細(xì)胞分化部分的空白，這為臨床提供了現(xiàn)今最好的治療指導(dǎo)。