鐘偉杰 劉文武 李 軼△

（1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200011；2 海軍特色醫(yī)學(xué)中心潛水與高氣壓醫(yī)學(xué)研究室，上海 200433）

卒中是由大腦血供不足而導(dǎo)致腦組織缺血從而引發(fā)的一系列危及生命的癥狀[1]，主要分為缺血性卒中和出血性卒中。盡管近年來(lái)卒中的發(fā)病率仍在增加，但是由于卒中預(yù)防教育的加強(qiáng)、卒中中心的建立、早診斷早治療以及護(hù)理質(zhì)量的改善等，卒中的死亡率趨于下降[2]。但是，卒中仍然是全球第二大最常見的疾病，全世界9%的死亡與卒中相關(guān)[3]。當(dāng)前，卒中的治療主要包括溶栓治療、抗凝、抗血小板以及活性氧清除、內(nèi)皮一氧化氮合酶激活劑等[4]。其中僅溶栓治療的療效最為確切，但因受到溶栓時(shí)間窗的限制，導(dǎo)致溶栓治療的廣泛應(yīng)用受限。因此亟需進(jìn)一步開發(fā)用于治療卒中的新療法。

腦卒中可能通過(guò)谷氨酸的過(guò)度激活、離子失衡和過(guò)量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，其損傷機(jī)制有壞死或程序性細(xì)胞死亡的參與[5]。細(xì)胞凋亡、自噬和壞死性凋亡是研究較多的3種程序性細(xì)胞死亡方式。腦缺血研究表明，梗死區(qū)的神經(jīng)元主要表現(xiàn)為壞死，而在卒中后的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞凋亡是缺血半暗帶或壞死周圍組織神經(jīng)元的主要死亡形式[6]。細(xì)胞凋亡是一種受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡，在形態(tài)學(xué)上與壞死存在明顯不同[7]。長(zhǎng)期以來(lái)，細(xì)胞壞死被認(rèn)為是病理情況下（物理性或化學(xué)性刺激、缺氧、營(yíng)養(yǎng)不良等）出現(xiàn)的一種被動(dòng)死亡。隨著研究的進(jìn)展，有證據(jù)顯示，某些壞死細(xì)胞的死亡類似于細(xì)胞凋亡，也受到一定的調(diào)控。Chan等[8]于2003年首先提出“壞死性凋亡”這一概念。2005年，Degterev等[9]在缺血性腦損傷模型中抑制caspase-8后發(fā)現(xiàn)，necrostatin-1（Nec-1）可抑制由Fas /腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）下游的受體相互作用蛋白1（receptor-interacting protein kinase 1，RIP1）介導(dǎo)的細(xì)胞壞死，而非細(xì)胞凋亡。種種研究表明，這種類型的細(xì)胞死亡受到調(diào)控，并且發(fā)生于凋亡之后，被稱為“壞死性凋亡”（necroptosis）[10]。近年研究表明，壞死性凋亡與多種疾?。òㄗ渲校┑闹虏∮嘘P(guān)[11]。本文主要介紹壞死性凋亡抑制劑的研究進(jìn)展，基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究總結(jié)壞死性凋亡在卒中致病中的作用，并提出靶向壞死性凋亡在腦卒中治療時(shí)存在的一些問題。

1 壞死性凋亡的概述

壞死性凋亡與凋亡、自噬是研究較多的細(xì)胞死亡模式，主要基于形態(tài)學(xué)特征、死亡途徑與方式以及是否可控等特征進(jìn)行區(qū)分。形態(tài)學(xué)上，壞死性凋亡的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及線粒體等細(xì)胞器會(huì)發(fā)生腫脹，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡化，但壞死性凋亡無(wú)核碎裂[12]。而細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器出現(xiàn)碎裂，細(xì)胞核出現(xiàn)凝聚和分裂，同時(shí)有凋亡小體的形成。對(duì)于細(xì)胞自噬，透射電鏡可觀察到其特有的3種形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，吞噬泡、自噬小體和自噬溶酶體[13]。調(diào)節(jié)這3種程序性死亡的途徑也存在差異，各自也有特殊的分子標(biāo)志物。壞死性凋亡通過(guò)RIP1、RIP3和MLKL來(lái)調(diào)節(jié)，并受半胱氨酸天冬氨酸酶的抑制作用。而凋亡主要通過(guò)Bcl-2家族蛋白信號(hào)途徑調(diào)節(jié)，與半胱氨酸天冬氨酸酶的活化密切相關(guān)[5]。細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白（autophagy-related gene product，ATG）被認(rèn)為是參與自噬體形成過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）則常被應(yīng)用于細(xì)胞自噬體數(shù)量的檢測(cè)[13]。

研究表明，諸多因素都會(huì)觸發(fā)壞死性凋亡，包括：腫瘤壞死因子（TNF）家族成員、Toll樣受體激活（TLRs）及其他病原微生物等[14]。當(dāng)半胱氨酸蛋白酶8（caspase 8）受到抑制時(shí)，細(xì)胞凋亡被抑制，壞死性凋亡被活化[15]。RIP1和RIP3結(jié)合形成被稱為“壞死小體”的復(fù)合物，而后誘導(dǎo)RIP3自磷酸化。RIP3使混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）磷酸化，誘導(dǎo)MLKL寡聚物形成，移位至細(xì)胞膜，導(dǎo)致其破裂，最終破壞細(xì)胞[16]。并且，細(xì)胞壞死性凋亡會(huì)進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)以及線粒體氧化應(yīng)激形成惡性循環(huán)[5]。

RIP家族包括RIP1～7，其中與壞死性凋亡關(guān)系最密切的是RIP1和RIP3[17]。兩者均含有1個(gè)絲氨酸-蘇氨酸結(jié)構(gòu)域，并且具有激酶和非激酶的作用。RIP1的中間結(jié)構(gòu)為RIP同型結(jié)構(gòu)域（RIP homotypic interaction motif，RHIM），后者發(fā)揮啟動(dòng)多個(gè)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。RIP3具有和RIP1相似的RHIM[18]。RIP1與RIP3之間便是通過(guò)其RHIM結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合而形成“壞死小體”。而且RIP3可以通過(guò)其RHIM序列與其他信號(hào)分子相互作用從而對(duì)壞死性凋亡的信號(hào)進(jìn)行整合[19]。RIP1與RIP3的結(jié)合則會(huì)招募MLKL，并觸發(fā)其構(gòu)象改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂[20]。因此，壞死性凋亡研究中常通過(guò)檢測(cè)RIP1、RIP3及其兩者的結(jié)合來(lái)評(píng)價(jià)。

2 壞死性凋亡的抑制

對(duì)于壞死性凋亡的認(rèn)識(shí)，主要來(lái)源于壞死性凋亡抑制劑以及基因修飾技術(shù)。迄今為止，人們已經(jīng)開發(fā)了一些壞死性凋亡的抑制劑。

2.1 RIP1抑制劑

2005年，在篩選小分子表型時(shí)發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)壞死性凋亡抑制劑Nec-1，它可抑制RIP1激酶和吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）的活性。目前，已經(jīng)開發(fā)出幾種結(jié)構(gòu)不同的Nec（Nec-1、Nec-3、Nec-4、Nec-5、Nec-7），其中Nec-7不具備抑制RIP1激酶的作用[21]。Nec-1 stable（Nec-1s；7-Cl-O-Nec-1）是Nec-1的類似物，它不會(huì)抑制IDO活性，而且血漿穩(wěn)定性和RIP1的特異性增加，也無(wú)類似Nec-1的毒性[22]。

2.2 RIP3抑制劑

目前有3種RIP3激酶抑制劑：GSK'840、GSK'843和GSK'872。與RIP1激酶抑制劑相比，GSK'840、GSK'843和GSK'872能高特異性地結(jié)合激酶結(jié)構(gòu)域，并抑制激酶活性，靶向壞死性凋亡的作用更廣泛[23]。但是，GSK'840在人體細(xì)胞能發(fā)揮作用，而對(duì)小鼠細(xì)胞無(wú)影響，這妨礙了它在鼠模型中的評(píng)估。

2.3 MLKL抑制劑

Necrosulfonamide（NSA）是一種抑制MLKL的復(fù)合物，用于確認(rèn)MLKL為RIP3的下游靶標(biāo)。由于NSA能烷基化人MLKL的Cys86，而鼠MLKL中不存在Cys86，因此NSA無(wú)法抑制鼠細(xì)胞的壞死性凋亡，不適合用于鼠臨床前研究。

3 壞死性凋亡與腦卒中

3.1 腦卒中體外研究

一些研究表明，壞死性凋亡與卒中的致病密切相關(guān)，因?yàn)槭褂肗ec-1等抑制劑或?qū)乃佬缘蛲鱿嚓P(guān)蛋白進(jìn)行基因調(diào)節(jié)，可改善卒中后的腦損傷和神經(jīng)功能。Liu等[24]報(bào)道TNF-α誘導(dǎo)的HT-22海馬神經(jīng)元毒性與壞死性凋亡有關(guān)，且這些細(xì)胞僅在半胱天冬酶阻斷后才對(duì)TNF-α敏感，隨后發(fā)生壞死，并且敲低去泛素化酶（cylindromatosis，CYLD）、RIP1、RIP3或MLKL可以抑制細(xì)胞壞死性凋亡。在對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元（HT-22）細(xì)胞中顯示，壞死性凋亡與多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly（ADP ribose）-polymerase， PARP）活化有關(guān)[25]。研究采用血紅蛋白或血紅素處理神經(jīng)元，模擬顱內(nèi)出血，結(jié)果觀察到鐵死亡和壞死性凋亡，但未觀察到caspase依賴的凋亡或自噬，而抑制壞死性凋亡，對(duì)血紅蛋白或者血紅素誘導(dǎo)的毒性具有保護(hù)作用[26]。Qu等[27]研究了MLKL介導(dǎo)的缺血缺氧后神經(jīng)元損傷機(jī)制。氧-糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）環(huán)境下，神經(jīng)元給予caspase抑制劑ZVAD處理后，RIP1和RIP3表達(dá)上調(diào)，RIP1和RIP3與MLKL相互作用增加，而MLKL表達(dá)沉默后能改善OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死性凋亡。腦缺血體外模型中，RIP1和RIP3表達(dá)增加和形成壞死小體，并且OGD后caspase 8 mRNA的表達(dá)瞬時(shí)降低；RIP3敲除能改善OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死性凋亡，而RIP3過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死性凋亡惡化[28]。有研究顯示，壞死性凋亡是缺血性損傷后24 h內(nèi)細(xì)胞死亡的早期機(jī)制[29]，這一點(diǎn)與細(xì)胞凋亡不同[30]。

OGD處理的少突膠質(zhì)細(xì)胞，RIP3表達(dá)上調(diào)，RIP3與RIP1、MLKL和CaMKⅡδ的相互作用增加，而抑制RIP3-MLKL或RIP3-CaMKⅡδ相互作用則可抑制OGD誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡，而抑制RIP3-RIP1相互作用后未觀察到該現(xiàn)象[31]。Dai等[32]報(bào)道，鐵超載也可導(dǎo)致原代皮質(zhì)神經(jīng)元壞死性凋亡，而姜黃素能抑制氯化亞鐵誘導(dǎo)的壞死性凋亡。興奮毒性也是缺血性卒中時(shí)組織損傷的關(guān)鍵機(jī)制。研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元興奮性毒性也與壞死性凋亡有關(guān)[33]。

3.2 缺血性腦卒中動(dòng)物研究

Degterev等[9]首次發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡與大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）導(dǎo)致的腦損傷有關(guān)，且其致病機(jī)制與凋亡不同，Nec-1可抑制壞死性凋亡的關(guān)鍵步驟（而非凋亡），對(duì)MCAO動(dòng)物發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。動(dòng)物研究顯示，中度缺血性腦卒中，壞死性凋亡主要見于病變中心，重度缺血性腦卒中周圍的壞死性凋亡比中度損傷腦組織明顯更多，并且壞死性凋亡細(xì)胞在周圍梗塞區(qū)域和病變核心一樣活躍[34]。腦缺血再灌注損傷可通過(guò)誘導(dǎo)壞死性凋亡，促進(jìn)腦出血和神經(jīng)炎癥反應(yīng)；RIP1活化先誘導(dǎo)壞死性凋亡，隨后出現(xiàn)凋亡[35]。有研究者也評(píng)估了腦卒中時(shí)壞死性凋亡的細(xì)胞特異性：caspase 8主要見于神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞和Iba-1陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞，而NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元中不表達(dá)。因此，caspase 3和caspase 8可能不參與海馬CA1神經(jīng)元壞死性凋亡的調(diào)節(jié)[36]。全腦缺血模型中，再灌注之前皮層就出現(xiàn)壞死性凋亡，再灌注后72 h仍可檢測(cè)到，而且海馬的壞死性凋亡不如大腦皮質(zhì)明顯；并且壞死性凋亡與TNFR1無(wú)關(guān)[37]。

研究主要通過(guò)基因調(diào)節(jié)或抑制劑對(duì)壞死性凋亡進(jìn)行干預(yù)，探討壞死性凋亡與腦卒中的關(guān)系。Degterev等是最早研究Nec-1神經(jīng)保護(hù)作用的團(tuán)隊(duì)。隨后，不同的研究團(tuán)隊(duì)在不同的腦卒中模型中證實(shí)了壞死性凋亡抑制的神經(jīng)保護(hù)作用。研究顯示，Nec-1對(duì)由缺血再灌注損傷引起的海馬神經(jīng)元壞死性凋亡的保護(hù)作用與抑制RIP3上調(diào)和核轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[36]。RIP1激酶突變、RIP3敲除和MLKL敲除通過(guò)阻斷壞死性凋亡對(duì)大鼠MCAO誘導(dǎo)的急性腦缺血發(fā)揮保護(hù)作用。急性缺血性卒中疾病中，RIP1和RIP3活化導(dǎo)致炎癥相關(guān)信號(hào)途徑激活[37-38]。敲除RIP1對(duì)神經(jīng)元損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可能與抑制RIP1-RIP3結(jié)合誘導(dǎo)的氧化損傷和炎癥有關(guān)[39]。在新生鼠缺血缺氧性腦病模型中，抑制RIP3-MLKL或RIP3-CaMKⅡδ的相互作用，能緩解髓鞘損傷[31]。Xu等[40]報(bào)道，Nec-1對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，同時(shí)給予凋亡抑制劑Gly（14）-humanin具有協(xié)同神經(jīng)保護(hù)作用。全腦缺血再灌注損傷模型中，Nec-1和3MA（自噬抑制劑）預(yù)處理能顯著抑制神經(jīng)元壞死性凋亡和大鼠死亡率，并且損傷后伴有RIP3和AIF的核易位、共定位以及兩者之間的相互作用[41]。在高糖血癥小鼠腦缺血再灌注損傷模型中，也證實(shí)了Nec-1s的神經(jīng)保護(hù)作用[42]。此外，即使在損傷發(fā)生后6 h使用Nec-1s，也可觀察到神經(jīng)保護(hù)作用。他們推測(cè)，Nec-1s可延長(zhǎng)神經(jīng)保護(hù)的時(shí)間窗，另一方面反映了卒中時(shí)壞死性凋亡的延遲誘導(dǎo)[40]。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor-associated factor 2，TRAF2）也與小鼠MCAO誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死性凋亡有關(guān)，而Nec-1預(yù)處理能抑制TRAF2敲除導(dǎo)致的細(xì)胞壞死性凋亡[43]。近期研究顯示，RIP3敲除能抑制血腦屏障損傷和炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，MCAO能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1（transforming growth factor-activated kinase 1，TAK1）（RIP1的一個(gè)抑制劑）的降解，并誘導(dǎo)壞死性凋亡向凋亡過(guò)渡；而敲除小膠質(zhì)細(xì)胞/浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞和神經(jīng)元的TAK1，可加重腦缺血[35]。在缺血再灌注損傷模型中顯示，M1型巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌TNF-α，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞壞死性凋亡，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，而給予英夫利昔單抗（TNF-α單抗）可明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞壞死性凋亡，抑制血腦屏障通透性增加，從而改善卒中預(yù)后[44]。此外，缺血后1 h和24 h給予salubrinal（選擇性eIF2α抑制劑），能抑制壞死性凋亡和神經(jīng)元丟失，說(shuō)明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也參與了壞死性凋亡[37]。以上證據(jù)表明，壞死性凋亡與缺血性卒中密切相關(guān)，并且對(duì)其進(jìn)行調(diào)控可以改善缺血性卒中后腦損傷和神經(jīng)功能。

3.3 出血性腦卒中動(dòng)物研究

在膠原酶誘導(dǎo)的腦出血模型中，腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）后24 h電鏡下觀察到壞死性凋亡的超微結(jié)構(gòu)，而RIP3缺陷小鼠ICH后壞死性凋亡細(xì)胞較少[45]。在自體血注射的蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）模型中，Shuai等[46]報(bào)道，SAH后RIP3在大鼠腦表達(dá)增加，損傷后24 h達(dá)到峰值。此外，使用RIP3抑制劑（GSK872）或者敲除RIP3可降低SAH誘導(dǎo)的腦損傷，而過(guò)表達(dá)RIP3則加重腦損傷和神經(jīng)損傷。通過(guò)藥物抑制RIP1或基因敲除RIP1，能改善ICH動(dòng)物的腦水腫和神經(jīng)系統(tǒng)功能，含氧血紅蛋白誘導(dǎo)的離體細(xì)胞模型中也證實(shí)該結(jié)果[47]。Nec-1可顯著減少膠原酶誘導(dǎo)的ICH動(dòng)物腦血腫體積，抑制細(xì)胞壞死性凋亡，減少血腦屏障開放，緩解水腫，改善神經(jīng)行為學(xué)[48]。在血管內(nèi)穿刺誘導(dǎo)的SAH大鼠模型中顯示，腦內(nèi)RIP1、RIP3、磷酸化DRP1和NLRP3炎癥小體含量增加，而給與Nec-1能抑制RIP1、RIP3、磷酸化DRP1表達(dá)和NLRP3炎癥小體，減輕腦損傷[49]。SAH后腦室內(nèi)給予Nec-1，可抑制cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的下降，從而抑制壞死性凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[50]。此外，Nec-1預(yù)處理能抑制SAH大鼠腦內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶9活化，從而減少緊密連接蛋白的降解，抑制血腦屏障通透性增加和神經(jīng)炎癥，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[51]。Nec-1在抑制壞死性凋亡的同時(shí)，也能通過(guò)抑制凋亡和自噬，對(duì)ICH發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

4 展望

在過(guò)去對(duì)卒中的研究中，大量的藥物在臨床前研究被證明有效，但并未在后續(xù)的臨床試驗(yàn)中獲得證實(shí)。因此，對(duì)于壞死性凋亡在臨床卒中的治療作用，還需要大量的研究進(jìn)行探索。除此之外，卒中時(shí)其他細(xì)胞是否也會(huì)出現(xiàn)壞死性凋亡及其在卒中中的致病作用，也需要進(jìn)一步的探究?？偟膩?lái)說(shuō)，盡管抑制壞死性凋亡很有可能作為臨床上治療卒中的靶標(biāo)，但仍需更多的臨床前和臨床研究以證實(shí)這些治療的療效及其安全性，為臨床使用奠定基礎(chǔ)。