宋紅梅 周康奇 田 雪 汪學(xué)杰 劉 超 劉 奕 牟希東 胡隱昌

橘色雙冠麗魚黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定*

宋紅梅1周康奇2田 雪3汪學(xué)杰1劉 超1劉 奕1牟希東1胡隱昌1①

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部休閑漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省現(xiàn)代休閑漁業(yè)工程技術(shù)研究中心 廣東 廣州 510380；2. 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶 402460; 3. 河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 河南 新鄉(xiāng) 453007)

為探討橘色雙冠麗魚()黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定方法，觀察魚類色素細(xì)胞生長特征，本研究以橘色雙冠麗魚的尾鰭、鱗片、皮膚組織為材料，在25℃～28℃條件下，分別在胰蛋白酶溶液和膠原酶溶液中消化6h和12h，可有效分離出色素細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞懸液經(jīng)氣孔尼龍網(wǎng)過濾后，于35%-45%-55% Percoll試劑中梯度分離和收集黃色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞。采用K-SFM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)和細(xì)胞純化，抑制成纖維細(xì)胞和角朊細(xì)胞的生長，用十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)、雙抗、bFGF的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行色素細(xì)胞傳代培養(yǎng)；運(yùn)用巴染色和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。結(jié)果顯示，細(xì)胞分離時(shí)，黑色素細(xì)胞位于Percoll試劑45%和35%濃度層之間，黃色素細(xì)胞位于Percoll試劑35%濃度層上，2種色素細(xì)胞均凝聚成絮狀。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，黑色素細(xì)胞內(nèi)部含大量黑色素小體，而黃色素細(xì)胞內(nèi)部含喋呤體和類胡蘿卜素囊泡；黑色素細(xì)胞左旋多巴(L-DOPA)染色呈陽性；取第10代色素細(xì)胞進(jìn)行體色相關(guān)基因黑皮素1受體(melanocortin receptor 1,)、酪氨酸酶(tyrosinase,)和()PCR檢測，顯示基因擴(kuò)增條帶特異性強(qiáng)，表明獲得的2種色素細(xì)胞具有良好的生物學(xué)活性。本研究建立了橘色雙冠麗魚黃色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定方法，為進(jìn)一步開展魚類體色細(xì)胞分化和體色形成的分子機(jī)理研究提供了細(xì)胞模型。

橘色雙冠麗魚；色素細(xì)胞；分離；培養(yǎng)；鑒定

體色是魚類獨(dú)特的表型和經(jīng)濟(jì)性狀(Sk?ld, 2013)，尤其對于觀賞魚類，體色和斑紋直接決定其觀賞價(jià)值和市場價(jià)值。魚類體色繁雜多樣、五彩斑斕，深入認(rèn)識魚類體色形成的調(diào)控機(jī)制，尋求人工改良魚類體色的有效途徑，是一個(gè)非常值得探索的課題。魚類體色的形成和維持受到一系列細(xì)胞、基因和生理因素的復(fù)雜調(diào)控(Colihueque, 2010)，其體色構(gòu)成不僅與色素合成有關(guān)，更取決于皮膚、鱗片和鰭條所含色素細(xì)胞的種類、數(shù)量、分布及色素細(xì)胞之間的相互作用(Inaba, 2012)。色素細(xì)胞是魚類體色形成的基本單位和重要載體，目前，已報(bào)道魚類至少有黃色素細(xì)胞(xanthophores)、紅色素細(xì)胞(erythrophores)、虹彩細(xì)胞(iridophores)、白色素細(xì)胞(leucophores)、黑色素細(xì)胞(melanophores)、藍(lán)色素細(xì)胞(cyanophores)和紫紅色素細(xì)胞(erythro-iridophores) 7種不同的色素細(xì)胞(徐偉等, 2007; Goda, 2011; Inaba, 2012; Singh, 2015)。

成功分離和體外培養(yǎng)色素細(xì)胞是探究動(dòng)物體色相關(guān)基因生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，也是了解魚類體色形成和體色變異分子機(jī)理的前提(Gola, 2012; Shigeki, 2011)。Eisinger等(1982)通過0.25%胰酶消化處理人包皮組織后，通過添加十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)和霍亂毒素(CT)首次成功分離和體外培養(yǎng)了人的黑色素細(xì)胞；Tamura等(1987)通過人胚胎提取物和TPA，成功從小鼠皮膚獲得黑色素細(xì)胞。此后，研究者也相繼在其他動(dòng)物皮膚中成功分離黑色素細(xì)胞，如羊駝()(白瑞等, 2013)、烏骨雞()(田穎剛等, 2014)、狐() (鮑加榮, 2015)。但鮮見魚類色素細(xì)胞分離培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道。本研究在參考之前哺乳動(dòng)物等色素細(xì)胞提取研究的基礎(chǔ)上，以具有典型體色褪色過程(黑色–灰色–亮黃色)的橘色雙冠麗魚()為實(shí)驗(yàn)對象，構(gòu)建魚類體表黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定方法，旨在為魚類體色基因功能研究提供細(xì)胞模型，為利用體外培養(yǎng)色素細(xì)胞進(jìn)行魚類色素細(xì)胞分化和體色形成機(jī)理的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用橘色雙冠麗魚采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所觀賞漁業(yè)研究基地，挑選健碩無傷的魚暫養(yǎng)，黑色時(shí)期平均體長為(5.0±0.5) cm，黃色時(shí)期平均體長為(7.0±0.5) cm，保證日常投喂和正常光照，控制適宜的養(yǎng)殖水溫(23℃～28℃)和充足的溶氧。

1.2 主要試劑

K-SFM培養(yǎng)基、DMEM basic (1×)培養(yǎng)基、bFGF (堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、大豆胰蛋白抑制劑均購自Gibco (美國)；胰蛋白酶(Typsin 1∶250 for biochemistry)、EDTA(乙二胺四乙酸)、TPA、DNaseⅠ(脫氧核糖核酸酶Ⅰ)、99%胎牛血清(FBS)、膠原酶Ⅰ(CollageⅠ)、DMSO(二甲基亞砜)均購自Sigma公司(美國)；左旋多巴(L-DOPA)均購自MCE(美國)；牛血清蛋白、Percoll溶液購自Invitrogen公司(美國)；新潔爾滅(利爾康，山東)；PBS緩沖液、SSC雜交緩沖液(海利克思，上海)；RNA提取試劑盒Total RNA kitⅡ購自O(shè)MEGA公司(美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA synthesis kit購自TaKaRa (日本)；雙抗原液(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所；其他常規(guī)藥品購自廣州康龍生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織的消化處理與色素細(xì)胞分離 取所需魚鰓放血致死，用0.1%新潔爾滅洗魚體3次，再用75%酒精消毒魚全身。常溫下取所需魚尾鰭、皮膚、鱗片組織，將采集的組織剪碎至1 mm3大小的塊狀，轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加入胰蛋白酶溶液40～45 mL，混勻，25℃～28℃下消化6～8 h。棄胰蛋白酶溶液，用1×PBS在1000 r/min離心沖洗5 min，重復(fù)5次，去除表皮組織碎塊。加入膠原酶溶液混勻，25℃～28℃下消化12～15 h。轉(zhuǎn)入25 μm氣孔尼龍網(wǎng)過濾分裂組織，放置5 min，800 r/min離心8 min，過濾得液體。吸取2 mL細(xì)胞溶液樣品，置于Percoll分層試劑(濃度梯度為55%-45%-35%)，1000 r/min離心20～25 min，使色素細(xì)胞分離于不同濃度層。

1.2.2 色素細(xì)胞的培養(yǎng)、純化與傳代 將分離的色素細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至KCl細(xì)胞培養(yǎng)基中，吹打均勻，取1滴溶液接種于5mL KCl培養(yǎng)基的25mL不透氣培養(yǎng)瓶中，置于28℃培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)，并放入一杯水，保證培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度。

每3 h觀察原代細(xì)胞生長情況，原代細(xì)胞長至約90%時(shí)，去培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化，消化后去酶液，加入KC培養(yǎng)基純化細(xì)胞，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，獲得純化的色素細(xì)胞。

純化過的基礎(chǔ)原代細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%～90%時(shí)，加入MC2培養(yǎng)基，將細(xì)胞重懸，進(jìn)行細(xì)胞傳代。即在新25 mL不透氣培養(yǎng)瓶中加入MC2培養(yǎng)基5mL，加入1滴純化過的細(xì)胞，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對2～3代細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察比較。

1.2.3 色素細(xì)胞的顯微觀察鑒定 參考常用黑色素細(xì)胞的DOPA染色法(Wang, 2013)，分別取第3代生長旺盛的2種色素細(xì)胞各15mL，加入4%多聚甲醛固定10 min，用1×PBS洗滌3次，加入0.1% L-DOPA溶液，孵育4 h，2 h換液1次，制作細(xì)胞爬片，鑒定色素細(xì)胞的活性和生長情況。

再各取第3代生長旺盛的2種色素細(xì)胞15 mL，1000 r/min離心3 min，棄上清液，加入1.5 mL 4%戊二醛固定液固定，保存于4℃。在JEM-1400PLUS型透射電子顯微鏡(日本HITACHI)下觀察拍照，分析色素細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 色素細(xì)胞體色相關(guān)基因PCR鑒定 分別取第10代生長旺盛的2種色素細(xì)胞，用Total RNA KitⅡ(OMEGA)提取RNA，用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA synthesis kit (TaKaRa)合成得到cDNA。

根據(jù)從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索與橘色雙冠麗魚序列及相關(guān)同源物種的基因，采用Primer Premier 6.0進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)(表1)，引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。以2種色素細(xì)胞提取RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用3對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μL)：ddH2O 32.5μL，10×buffer 5 μL，dNTPs 8μL，模板cDNA (200 ng/μL) 2 μL，酶0.5 μL，正反向引物(10μmol/L)各1 μL。PCR參數(shù)：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，退火60 s (退火溫度見表1)，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

2 結(jié)果

2.1 橘色雙冠麗魚色素細(xì)胞分離、培養(yǎng)和觀察

2.1.1 色素細(xì)胞提取 以2個(gè)典型褪色時(shí)期“黑色期和黃色期”橘色雙冠麗魚為材料，提取獲得的2種色素細(xì)胞均保持原有顏色(圖1A)。通過Percoll試劑55%-45%-35%濃度梯度離心分層，黑色素細(xì)胞位于梯度層的45%～35%之間(圖1B箭頭b所指)，而黃色素細(xì)胞位于35%濃度層上(圖1B箭頭a所指)。取2種色素置于同一Percoll濃度梯度試劑離心，2種色素細(xì)胞均能明顯分離和分層，黑色素細(xì)胞在下層(圖1C箭頭b所指)，位于45%～35%之間，黃色素細(xì)胞位于35%濃度層表面(圖1C箭頭a所指)。

圖1 橘色雙冠麗魚色素細(xì)胞分離

2.1.2 分離培養(yǎng)后色素細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較觀察 初步分離的2種色素細(xì)胞均凝聚呈絮狀，形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，絮狀物各自分布了大量黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞(圖2A、2B)；低倍鏡下觀察培養(yǎng)的第1代色素細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)黑色素細(xì)胞呈球狀，有零星色素顆粒散落出細(xì)胞外(圖2C)，而黃色素色素細(xì)胞全部為單個(gè)色素個(gè)體，分布在培養(yǎng)基表面。黃色素細(xì)胞在培養(yǎng)前期，細(xì)胞小，單個(gè)不聚攏(圖2D、2E)；經(jīng)過培養(yǎng)，細(xì)胞迅速生長，6～12 h覆蓋培養(yǎng)基表面約70%后細(xì)胞個(gè)體變大，慢慢聚攏；過夜培養(yǎng)至覆蓋培養(yǎng)基表面約90%時(shí)，大個(gè)體色素細(xì)胞聚攏(圖2F)，與在鱗片上直接觀察到的色素細(xì)胞形狀大小基本一致。

2.1.3 橘色雙冠麗魚體表色素細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 為與分離培養(yǎng)的色素細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行對比，分別從橘色雙冠麗魚“黑色–灰色–黃色”體色過渡期魚體上取下背部鱗片進(jìn)行色素細(xì)胞觀察，發(fā)現(xiàn)黑色魚體上的色素細(xì)胞占絕大比例，黑色素細(xì)胞單個(gè)成簇狀，有分散和聚攏2種形態(tài)(圖3A)?；疑~體上色素細(xì)胞數(shù)量少，個(gè)體小，有黑色和黃色色素同時(shí)存在，黑色素細(xì)胞顏色較黑色魚體鱗片上的淺，為棕色，細(xì)胞個(gè)體也較?。怀霈F(xiàn)的黃色素細(xì)胞為彌散狀，分布于黑色素細(xì)胞下層，色素細(xì)胞不顯現(xiàn)完整清晰的形狀(圖3B)。黃色魚體上基本無黑色素細(xì)胞，有數(shù)量較多、個(gè)體較大的黃色素細(xì)胞，有的細(xì)胞顏色較深且偏紅，呈凝聚狀，類似于紅色素細(xì)胞(圖3C)。

圖2 橘色雙冠麗魚色素細(xì)胞培養(yǎng)后形態(tài)學(xué)觀察

圖3 橘色雙冠麗魚鱗片色素細(xì)胞

2.2 2種色素細(xì)胞的顯微觀察與生物學(xué)鑒定

2.2.1 L-DOPA染色鑒定黑色素細(xì)胞酶的活性 取第3代生長旺盛的黑色素細(xì)胞進(jìn)行L-DOPA染色，在顯微鏡下觀察黑素細(xì)胞染色情況，可見斑點(diǎn)狀黑色或灰色黑色素細(xì)胞，L-DOPA染色呈陽性(圖4B)。黃色素細(xì)胞沒有多巴染色，還未見黃色素細(xì)胞酶活性的方法，只能從顯微鏡下觀察其生長情況。

2.2.2 透射電鏡分析 通過透射電鏡觀察黑色素細(xì)胞，可見其內(nèi)部含大量的黑色素小體(圖5A)。電鏡下，觀察到黃色素細(xì)胞內(nèi)部的喋呤體(圖5箭頭所指a)和類胡蘿卜素囊泡(圖5箭頭所指b)，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整。

2.2.3 2種色素細(xì)胞和基因的PCR檢測 第10代生長旺盛的黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞和的PCR檢測結(jié)果顯示，擴(kuò)增條帶特異性良好(圖6)，說明獲得的黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞均保持著較好的生物活性。

圖4 橘色雙冠麗魚黑色素細(xì)胞的L-DOPA染色

圖5 電鏡觀察黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)

3 分析與討論

在細(xì)胞分離培養(yǎng)中，運(yùn)用不同消化酶對組織進(jìn)行消化處理是影響細(xì)胞提取效果的重要因素，在常用的幾種組織消化酶中，DispaseⅡ酶對皮膚組織消化相對較弱，多應(yīng)用于哺乳動(dòng)物眼睛黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)(鮑加榮, 2015)；中性蛋白酶可選擇性作用于纖維蛋白、黏連蛋白和Ⅳ型膠原，破環(huán)板橋內(nèi)的結(jié)構(gòu)，但對于橋粒結(jié)構(gòu)作用卻很少，很難將表皮完全分散；胰蛋白酶能水解細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)，破環(huán)細(xì)胞間的半橋粒和橋粒結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞分散；膠原酶Ⅰ作用于結(jié)締組織中的膠原蛋白，對細(xì)胞間質(zhì)產(chǎn)生消化作用，且對細(xì)胞本身影響不大，能使細(xì)胞保持高活力(田穎剛等, 2014; 鮑加榮, 2015)。本研究參考Inaba等(2012)的方法并改進(jìn)，在25℃～28℃下用2.5 mg/mL的胰蛋白酶消化組織6～8 h，去除表皮細(xì)胞，再用0.1 mg/mL膠原酶Ⅰ配制的溶液進(jìn)行二次消化12～15 h，可分離獲得活性較高的色素細(xì)胞原液。分離的2種色素細(xì)胞在Percoll梯度試劑中低速離心后分層明顯，細(xì)胞層間隔35%的Percoll試劑層，推測黑色素細(xì)胞較黃色素細(xì)胞質(zhì)量重，確定2種色素細(xì)胞分離時(shí)所在Percoll試劑濃度層，可為下一步實(shí)驗(yàn)得到培養(yǎng)純化細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

圖6 色素細(xì)胞中TYR、EDNRB和MC1R基因的PCR片段擴(kuò)增

色素細(xì)胞體外培養(yǎng)一般采用K-SFM角朊細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM、M199等，比較K-SFM和DMEM/F12 2種培養(yǎng)基對羊駝毛囊干細(xì)胞生長和增殖的影響，發(fā)現(xiàn)K-SFM培養(yǎng)基更有利于毛囊干細(xì)胞增殖，培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)量多、增殖快，克隆生成能力更強(qiáng)(弓慧敏等, 2016)。田穎剛等(2014)以K-SFM培養(yǎng)基為原代培養(yǎng)和細(xì)胞純化，以DMEM培養(yǎng)基為最終傳代培養(yǎng)，成功建立烏骨雞黑色素細(xì)胞系。本研究借鑒哺乳動(dòng)物和鳥類(Deveci, 2001)的培養(yǎng)方法加以改進(jìn)，采用能抑制成纖維細(xì)胞和角朊細(xì)胞生長的K-SFM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)和細(xì)胞純化，以DMEM培養(yǎng)基為最終傳代培養(yǎng)，獲得生理狀態(tài)良好的色素細(xì)胞。

魚類的鱗片、皮膚和尾鰭有很多膠原纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞，數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞，因此，色素細(xì)胞培養(yǎng)中，雜細(xì)胞的去除非常關(guān)鍵，培養(yǎng)基中添加促癌因子TPA可對不同細(xì)胞產(chǎn)生選擇性毒性作用。TPA能促進(jìn)色素細(xì)胞分泌特定的生長因子，促進(jìn)細(xì)胞的生長、粘附和增殖，抑制成纖維細(xì)胞及角質(zhì)形成，達(dá)到避免成纖維細(xì)胞和膠質(zhì)污染，從而獲得純化的色素細(xì)胞(Yaar, 1991)。因此，本研究在原代培養(yǎng)和細(xì)胞純化時(shí)，增大TPA用量(10 ng/mL)，但傳代培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)減少TPA用量(1 ng/mL)，以減少對2種色素細(xì)胞的毒性作用。

本研究在鱗片上直接觀察到的黑、黃2種色素細(xì)胞個(gè)體分明，成群地分布在鱗片上，而提取到的2種色素細(xì)胞在低倍鏡下觀察呈絮狀，但也能看到一些單個(gè)的色素細(xì)胞，為判定所提取的色素細(xì)胞有無破裂、有無增殖能力及生物活性狀況等，對色素細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后顯微觀察，發(fā)現(xiàn)2種色素細(xì)胞均能正常生長，其中，黃色素細(xì)胞迅速生長，細(xì)胞個(gè)體變大后，慢慢聚攏成球狀。通過多巴染色和透射電鏡來觀察黑色素小體是鑒定黑色素細(xì)胞的經(jīng)典方法(Deveci, 2001; Fuller, 2001; Hu, 2007)。多巴染色培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，高倍透射電鏡觀察黑色素細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，顯現(xiàn)大量黑色素小體；黃色素細(xì)胞內(nèi)部可見喋呤體和類胡蘿卜素囊泡，2種色素細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)與在大麻哈魚(Walbaum)皮膚表面通過電鏡觀察到的狀態(tài)相似(Djurdjevi?, 2015)，佐證本研究所建立的提取、分離和體外培養(yǎng)橘色雙冠麗魚體表黑、黃2種色素細(xì)胞方法的可行性。

魚類體色的分布和形成主要由表現(xiàn)為黑色、棕色表型的真黑色素和表現(xiàn)為黃色、紅色表型的褐黑色素2種黑色素的相對數(shù)量及分布決定，二者均源于黑色素合成信號通路，都在酪氨酸基因()的調(diào)控下表達(dá)(Lin, 2007; 王成輝, 2012)。而基因和基因在黑色素合成通路中起著類似于“開關(guān)”的作用(Adalsteinsson, 1987; 蔣燕玲等, 2016)。在色素細(xì)胞發(fā)育中，基因能促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細(xì)胞分化為色素細(xì)胞(Parichy, 2000)。因此，本研究從黑、黃2種色素細(xì)胞中提取總RNA，檢測色素細(xì)胞中體色關(guān)鍵基因和的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)均能擴(kuò)增出特異性條帶，表明獲得的黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞具有良好的生物學(xué)狀態(tài)。

本研究利用Percoll梯度試劑分離橘色雙冠麗魚黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞，以K-SFM培養(yǎng)基(添加10 ng/mL TPA)進(jìn)行原代和純化培養(yǎng)，最后培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，并添加1 ng/mL TPA、20 ng/mL bFGF和1%雙抗的完全培養(yǎng)基中，建立了2種色素細(xì)胞的培養(yǎng)體系，并利用形態(tài)觀察、多巴染色、透射電鏡觀察和體色相關(guān)基因表達(dá)對培養(yǎng)細(xì)胞的特性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步構(gòu)建橘色雙冠麗魚黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)，為了解魚類色素細(xì)胞發(fā)育、體色形成及相關(guān)基因功能等提供參考。

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Isolation, Culture and Identification of Polychromatic Midas cichlids () Melanophores and Xanthophores

SONG Hongmei1, ZHOU Kangqi2, TIAN Xue3, WANG Xuejie1, LIU Chao1, LIU Yi1, MU Xidong1, HU Yinchang1①

(1. Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Leisure Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Guangdong Modern Leisure Fisheries Engineering Technology Research Center, Guangzhou, Guangdong 510380, China; 2. China Southwest University, Key Laboratory of Freshwater Fish Resources and Reproductive Development, Ministry of the Ministry of Education, Chongqing 402460, China; 3. College of Fisheries, Engineering Technology Research Center of Henan Province for Aquatic Animal Cultivation, Henan Normal University, Xinxiang, Henan 453007, China)

This study aimed to investigate the methods of isolation, culture, and identification of melanophores and xanthophores in polychromatic midas cichlids () and to thus observe the growth characteristics of pigment cells in fish. In this study, the caudal fin, scales, and skin tissues ofwere used as the experimental material. To separate the pigment cells, the tissues were digested in trypsin solution and collagenase solution for 6 h and 12 h, respectively,at 25℃～28℃. After the cell suspension was filtered through a stoma nylon net, xanthophores and melanocytes were separated and collected by means of 35%-45%-55% Percoll multilayer density gradient centrifugation. K-SFM medium was used for primary cell culture and cell purification to inhibit the growth of fibroblasts and keratinocytes. DMEM supplemented with phorbol ester (TPA), double resistance, and bEGF,., was used for the subculture of pigment cells. The morphology of the cells was observed by L-DOPA staining and transmission electron microscopy, and the cells were identified by molecular markers. The results showed that when the cells were separated, the melanocytes were located at the boundary of the 45% and 35% Percoll reagent layers, while xanthophores were located on top of the 35% Percoll layer. Both pigment cells condensed into flocculation. Transmission electron microscopy showed that the melanocytes contained a large number of melanosomes, while the yellow cells contained the MTX and carotenoid vesicles. The melanocytes were positive under L-DOPA staining. The 10th generation of pigment cells was used for PCR detection of the body color related genes,, and, which showed strong specificity of gene amplification bands, indicating that the two pigment cells obtained had good biological activity.In this study, methods for the isolation, culture, and identification of melanophores and xanthophores of polychromatic midas cichlids were successfully established, providing a cell model for further research on the molecular mechanisms of body color cell differentiation and body color formation in fish.

; Pigment cell; Separation; Cultivation; Identification

HU Yinchang, E-mail: huyc22@163.com

S917.4

A

2095-9869(2021)06-0053-08

10.19663/j.issn2095-9869.20200617001

http://www.yykxjz.cn/

宋紅梅, 周康奇, 田雪, 汪學(xué)杰, 劉超, 劉奕, 牟希東, 胡隱昌. 橘色雙冠麗魚黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(6): 53–60

SONG H M, ZHOU K Q, TIAN X, WANG X J, LIU C, LIU Y, MU X D, HU Y H. Isolation, culture and identification of polychromatic midas cichlids () melanophores and xanthophores. Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(6): 53–60

胡隱昌，研究員，E-mail: huyc22@163.com

2020-06-17,

2020-08-20

*國家自然科學(xué)基金青年基金(802037)、廣東省自然科學(xué)基金(2020A1515010304)和廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(202002030047)共同資助[This work was supported by the National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (802037),(2020A1515010304), and(202002030047)]. 宋紅梅，E-mail: shm1227@126.com

(編輯 馮小花)